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细胞骨架及miRNA在单纯疱疹病毒I型感染细胞中的作用及抗病毒药物的研究

郑楷  
【摘要】:研究背景:单纯疱疹病毒1型(HSV-1)是全球普遍感染的病原体之一,其通常引起龈口炎、角膜结膜炎、疱疹病毒性脑炎(HSE)等。HSV-1具有嗜神经性,能在中枢神经系统中建立潜伏感染,且在免疫低下等情况下复发。此外,HSV-1感染与神经退行性疾病如阿尔茨海默病等的发生发展密切相关,也是HIV并发感染的主要病原体。细胞骨架是真核细胞中与保持细胞形态结构和细胞运动有关的纤维网络,参与调控神经细胞的传导,分化等功能。细胞骨架的紊乱则会导致多种神经系统疾病的发生。前期研究发现HSV-1增殖与细胞骨架相关,但具体机制未知。 研究内容与结果:本论文首次探讨了HSV-1进入神经细胞过程中对细胞微丝骨架的调控机制。研究发现HSV-1进入神经细胞引起F-actin短暂的双向变构(先聚合后解聚),且与细胞骨架调控蛋白cofilin活性的开与关(去磷酸化与磷酸化)密切相关。过表达、下调或调控cofilin的活性都会抑制病毒的进入。进一步研究发现HSV-1病毒结合到位于细胞膜脂筏内的表面受体后激活EGFR-PI3K-Erk1/2-ROCK–LIMK信号通路,最终导致cofilin的磷酸化(失活)及F-actin的聚合。聚合的F-actin利于病毒受体的富集及高效穿膜过程的发生。而在病毒发生穿膜过程中,HSV-1通过未知途径激活PLCγ1及IP3R-1钙离子通道的打开,从而引起细胞内钙离子浓度的增加。后者激活磷酸酶SSH、Calpain-1及cofilin(去磷酸化),最终导致细胞膜下F-actin的解聚,从而将病毒颗粒从穿膜处释放并沿着微管向细胞核运输。研究也发现在HSV-1通过泛素化蛋白降解途径依赖的SSH的降解引起并募集失活的cofilin到细胞核中帮助病毒的复制。此外,HSV-1裂性感染编码产生许多miRNA,其中miR-H1表达量最多,但其作用及靶蛋白未知。在本研究中结合生物信息学等方法探讨了miR-H1潜在的靶蛋白及作用。结果表明miR-H1靶向于泛素化连接酶E3Ubr1。抑制miR-H1会减少病毒的增殖及晚期基因的合成。Ubr1的表达在病毒感染过程中被下调,其能识别病毒多个蛋白以及阿尔茨海默病标记蛋白β样淀粉蛋白并介导其降解。HSV-1通过miR-H1靶向于Ubr1,从而防止病毒蛋白的降解及促进阿尔茨海默病的发生。与此同时,本论文还研究了氯离子通道抑制剂抗HSV-1的作用及机制。氯离子通道抑制剂tamoxifen和NPPB对标准株和ACV耐药株都具有显著的抗病毒效果。HSV-1早期感染引起细胞内氯离子浓度的增加。Tamoxifen和NPPB能够抑制病毒基因的合成与蛋白质的表达,且作用于病毒增殖周期的多个阶段。Tamoxifen和NPPB抑制病毒的吸附、穿膜及入核运输,且通过抑制病毒在细胞膜脂筏的定位和钙离子的平衡阻断病毒的吸附。 研究结论与意义:EGFR-PI3K信号通路和钙离子信号通路有序的调控cofilin的活性(磷酸化与去磷酸化的转变)从而调节F-actin的动态变化(聚合与解聚)以促进HSV-1进入神经细胞。在HSV-1复制过程中,HSV-1编码的miRNAmiR-H1大量表达并用于下调泛素连接酶Ubr1,从而防止病毒蛋白被降解及开启晚期基因的表达。HSV-1还通过miR-H1促进β样淀粉蛋白的聚积。此外,氨离子通道抑制剂tamoxifen和NPPB具有显著的抗HSV-1作用。这些研究结果将会有助于了解病毒-宿主间的相互作用,丰富对病毒及病毒引起的疾病发生发展过程的认识,为发现新的抗HSV-1作用靶标提供科学依据等。


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