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蜡状芽胞杆菌对芘的生物降解及其降解基因的克隆与表达

卫昆  
【摘要】:本论文以蜡状芽胞杆菌(Bacillus cereus)为实验菌株,对水体中芘的微生物修复进行了研究,考察其对芘的降解性能,分析其代谢产物和相关功能基因及功能酶,以期从分子生物学角度阐明芘在菌体内的降解机理。B.cereus降解芘的最优无机盐培养基浓度为:K2HPO4 100 mg·L-1,KH2PO4100 mg·L-1,Mg SO4·7H2O 20 mg·L-1和柠檬酸钠100 mg·L-1。在降解体系中加入1mg·L-1 Mn2+、0.1 mg·L-1 Fe3+和10 mg·L-1葡萄糖混合物对芘的降解有明显促进作用;1 g·L-1菌体在120 h内对2.5μmol·L-1芘的降解率达到61.4%。利用LC-MS/MS分析芘代谢产物,检测到1-萘酚、2-萘酚、9-羟基菲和1-羟基芘4种单羟基多环芳烃,表明芘在单加氧酶作用下开环降解,且B.cereus能有效分解利用4种代谢产物,其最高利用率分别为100%,90.3%,98.3%和52.7%。酶活力分析实验结果表明,B.cereus具有的水杨酸羟化酶,邻苯二酚1,2-双加氧酶和邻苯二酚2,3-双加氧酶在芘的降解中起关键作用,其酶活力经芘诱导后均有明显提高。结合产物分析及酶活测定推断B.cereus对芘的降解途径以及降解过程是由单加氧酶和双加氧酶联合起作用。通过设计引物,利用PCR扩增技术,从B.cereus的质粒中克隆出邻苯二酚2,3-双加氧酶(C23O)基因,对其进行序列测定和分析。该基因全长924 bp,具有一个完整开放阅读框的序列,编码307个氨基酸氨基酸组成的C23O。理论蛋白分子量为35.16 k Da,等电点为5.46。编码区G+C含量为61.8%,A+T含量为38.2%。将该C23O基因序列与NCBI数据库中已收录的其它菌株的C23O基因序列进行比对,分析相关菌属亲缘进化关系,结果显示B.cereus的C23O基因与假单胞菌属(Pseudomonas)菌株C23O基因的相似性最高。利用p ET 32a(+)质粒对C23O基因构建了重组表达载体,成功在表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。重组菌株酶活检测表明,重组蛋白在表达宿主菌中主要以胞内酶的形式存在。


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