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产油微藻高效培养及其酶法制备生物柴油技术研究

王垚  
【摘要】:近年来,由于石油资源日益枯竭、环境保护尤其是CO2减排的迫切性等因素,生物能源的研发日益受到人们的重视。生物柴油是生物能源中的一种重要产品,制约其发展的关键问题集中在原料的可持续供应。微藻是目前生产生物柴油最有希望和前途的原料,它具有生长迅速、油脂含量高、环境适应力强,“不与粮争地,不与人争粮”等特点,微藻生物柴油产业化技术开发已成为近年来国内外生物能源领域中的研究热点。目前,通过培养能源微藻生产生物柴油的技术路线在实验室虽已打通,但是生产成本太高,经济效益并不明显,且微藻规模化培养生产及生物柴油制备方面的研究较少,这是制约微藻生物柴油商业化生产的瓶颈。主要体现在光生物反应器中微藻培养时生物质浓度低,生产效率低,培养过程中生物污染严重,造成生物质大量损失。此外,微藻生产效率低还限制了其在保健品、药物、化妆品、农用化学品和饲料等行业的开发与应用。本文主要研究了管道式光生物反应器改进对提高栅藻产量的影响及培养过程中生物污染防治对降低微藻生物质损失的影响。另外,还研究了酶促酯化反应体系中微藻粗脂和生物质不同底物对生物柴油产率的影响,主要结果如下:1、采用CFD模拟的方法,研究了内螺旋筋对管道中流体的影响。分析了内螺旋筋参数对流体旋流数的影响。(1)与普通管道相比,增加内螺旋筋可显著提高流体旋流数,在设定的内螺旋筋数量范围内,筋数越多流体旋流数越大,8根筋管道内流体具有最大的旋流数,较1根筋管道流体旋流数提高了2.5倍;(2)相同内螺旋筋数量,在设定的螺距范围内,螺距越小流体旋流数越大,相比1000 mm螺距,500 mm螺距管道流体旋流数提高了1.3倍。2、采用中试规模(1300 L)管道式光生物反应器进行室内24 h人工光源培养,研究了内螺旋筋管道对栅藻培养的影响,微藻产量同CFD模拟结果保持一致。内螺旋筋管道内栅藻的生长速率和细胞浓度明显高于普通管道。8根筋500 mm螺距管道内栅藻生长速率和细胞浓度最大,分别达到0.055 d-1和3.2 g·L-1,相比普通管道提高了45%。3、结合形态学观察与分子生态学技术(DGGE),研究了小球藻室外开放池培养过程中污染生物的种群构成和数量。共发现19种污染生物或操作分类单元,包括两种真菌、六种鞭毛虫、三种变形虫、两种丝足虫、三种纤毛虫、一种轮中和两种大型昆虫。发现一种敌害污染生物马勒姆杯状赭球藻(Poterioochromonas malhanensis)危害巨大,两天内可使小球藻数量减少8倍,而P.malhanensis数量增加15倍。另外,采用形态观察一年内跟踪研究了栅藻室外管道式光生物反应器培养过程中的污染生物种类,共发现13种污染生物,包括一种腔轮虫,三种变形虫(吮噬虫和两种未知种),六种纤毛虫(钟虫、肾形虫、四膜虫、膜袋虫、吸管虫和一种未知种)和三种鞭毛虫(金藻、眼虫和一种未知种)。除轮虫外,还发现一种敌害污染生物吮噬虫(Leptophrys sp.)危害巨大,三天内可使栅藻生物质降低1.98倍。4、采用超声波技术对微藻培养中污染生物进行防治。(1)研究了超声波对P.malhanensis和一种轮虫的致死作用。P.malhanensis和轮虫的致死率随着超声剂量的增加而增大并逐渐饱和,致死率最大分别可达88.6%和96.4%。(2)当超声波超声剂量范围在20 J·mL-1内,对不同生长时期和状态小球藻和栅藻的生长均不产生抑制作用,对细胞油脂含量也无明显影响。3 J·mL-1超声剂量甚至可促进延迟期栅藻的生长,培养10天后细胞浓度比对照组提高了18.8%。(3)超声波对小球藻培养中P.malhanensis污染的防治,发现超声波除可有效控制和预防P.malhanensis的污染外,还可去除或失活包括Colpodella sp.、Saccharomyces sp.、Brachionus calyciflorus、Bradysia sp.、Spumella spp.、Platycotis sp.、一种Orchitophryidae和两种真菌在内的10种污染生物,使小球藻培养中污染生物总类群降低52.6%。(4)敌害污染生物变形虫Leptophrys sp.对超声波不敏感,研究了调节pH对Leptophrys sp.的致死作用。发现利用CO2调节pH至6.0并保持4小时后,可使Leptophrys sp.数量持续降低9倍,栅藻生长未受明显影响。5、建立酶促酯化微藻全脂制备生物柴油的方法,研究了反应体系和反应条件对生物柴油转化率的影响。(1)反应体系中微藻油脂底物同叔丁醇存在最佳质量比,1:1时转化率最高;(2)转化率随着油脂甲醇摩尔比的升高而增大,超过1:12后转化率增大不显著;(3)反应温度位于25-55 oC之间时,其对转化率的影响不明显;(4)反应的最佳条件是25 oC,油脂叔丁醇1:1,油脂甲醇摩尔比1:12。反应4小时后,达到最大转化率99.1%;降低油脂甲醇摩尔比至1:3反应12小时后,转化率仍可达到95%;(5)最佳反应条件下反应4小时,不同油脂底物的转化率在75-99%之间,说明该体系对多种油脂底物具有良好的适应性;(6)N435酶在体系中预处理165小时后仍能保持90%以上的酶活,说明该体系降低了甲醇对酶的失活作用,酶在建立的反应体系中稳定性良好,适合多次使用。6、建立酶促酯化微藻生物质制备生物柴油的原位反应方法,研究了反应体系和反应条件对干藻粉制备生物柴油的影响。(1)体系中干藻粉叔丁醇质量比1:2时生物柴油产量最高;干藻粉甲醇质量比增大到2:1时获得最大生物柴油产量,继续增大甲醇比例不能继续提高生物柴油产量,相反叔丁醇比例过高后会产生稀释作用而降低底物浓度,从而影响产量;(2)当温度范围在25-45 oC之间时,温度越高,产量越高。提高温度可提高油脂的提取效率,从而增加生物柴油的产量;(3)优化后的反应条件是干藻粉叔丁醇甲醇比例2:4:1,反应温度25 oC,反应8 h后生物柴油产量比可达99.2%,同酶促酯化微藻全脂反应的产量相当;反应至12小时后藻粉底物同油脂底物生成生物柴油的产量比达最大值107.7%,超过酶促酯化微藻全脂反应的产量;(4)N435酶在该体系中预处理55 d后仍能保持95%以上的酶活,说明酶在该反应体系中稳定性良好,适合多次使用。另外,使用同样的思路研究了反应体系和反应条件对湿藻泥制备生物柴油的影响。优化后的反应条件是湿藻泥叔丁醇甲醇比例1:1:2,反应温度45 oC,反应16小时后生物柴油产量比最大可达81.5%。N435酶在含水体系中预处理4天后酶活降至57.8%,水的存在严重影响酶的稳定性。


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