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抗菌融合肽MAE基因mae的亚克隆、表达和抗菌抑癌活性研究

石强  
【摘要】: MAE是本实验室设计、化学合成的具有理想抗菌活性的融合抗菌肽,来源 于蛙皮素的N端和蜂毒素的N端,中间加上铰链区AGP(Ala-Gly-Pro),已根 据其氨基酸残基序列设计了mae基因(全长81bp),并已克隆到pTYB2,并 在大肠杆菌ER2566中表达。但该系统表达的目的蛋白MAE分子量太小,量 也少,难以检测到。 本文把mae基因从pTYB2-mae亚克隆到pMYB5,即设计上下游引物, 双酶切PCR产物和载体pMYB5进行定向克隆,经过鉴定、测序,证实已克 隆成功。大肠杆菌ER2566(pMYB5-MAE)诱导表达的产物过几丁质亲和 层析柱,纯化得到融合表达的MBP-MAE,其分子量较大,即使有少量表达 也比较容易检测。同时,在MAE的N端有麦芽糖结合蛋白,在C端有内蛋 白子,使之表达稳定。MBP-MAE通过CNBr切割,可将MAE切下来,根据 MAE的阳离子多肽的特性,通过CM(羧甲基纤维素)阳离子交换层析,将 MAE从切割后的片段中分离出来。 MAE作为一种药物,具有抗菌抑癌活性,本文利用合成的抗菌肽MAE 进行了抗菌和抑癌的实验。以合成的MAE通过琼脂糖孔穴扩散法实验证实, MAE对16种G~+和G~-细菌均有不同程度的杀伤作用,作用的浓度可以低至 37.5ug/ml。扫描电镜观察到:MAE在癌细胞的细胞膜上形成很明显的孔洞, 使细胞内容物外泄,是造成癌细胞死亡的重要原因。MTT法显示,MAE浓 度越高,对细胞的杀伤作用越强,但细胞克隆实验结果表明,MAE对细胞作 用的理想终浓度为1.56ug/ml。


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