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小鼠胎肝Sca-1~+细胞及人胎肝CD34~+细胞向神经组织细胞分化研究

刘革修  
【摘要】: 目的: 了解胎肝干细胞在体内外是否具有向神经组织细胞分化的潜能,即可塑性,以进一步探索其分化规律;建立胎肝来源的细胞在体外向神经组织细胞分化模型。 拟从下面三个方面研究:小鼠胎肝Sca-1~+细胞在体内向神经组织细胞分化研究;体外诱导小鼠胎肝Sca-1~+细胞向神经组织细胞分化研究;体外诱导人胎肝CD34~+细胞向神经组织细胞分化研究。 材料方法: 1.观察小鼠胎肝Sca-1~+细胞移植后在受体鼠脑组织中的分化情况 利用快速的PCR扩增小鼠Y染色体特异的性别决定区蛋白基因(sex determing region protein,Sry)方法鉴定孕14.5d C57BL/6J胎鼠性别(总时间小于3.5h),免疫磁珠法分离雄性胎鼠肝的Sca-1~+细胞,尾静脉注射Sca-1~+细胞(2.0×10~3个/小鼠)到致死剂量(10.0Gy)放射线照射的8-10周C57BL/6J雌性小鼠(辐射后4h内注射),然后将实验小鼠饲养在无菌动物室。移植2、4、6月后断髓处死小鼠,取材制作石蜡或者冰冻切片。将受体小鼠脑组织作免疫组化和FISH双染色,以了解是否有供体来源的细胞、是否具有神经组织细胞表面标志特点。移植后5、10、15、20、60、120天断尾取血,作血象观察和sry基因PCR扩增,股骨骨髓切片作HE染色,以分析造血重建情况。 2.体外诱导小鼠胚胎肝Sca-1~+细胞向神经组织细胞分化研究 采用免疫磁珠法分离孕14.5d C57BL/6J胎鼠肝的Sca-1~+细胞,接种在10-cm塑料平皿或者培养瓶中(密度5×10~5 cells/cm~2),以DMEM/F12+10%胎牛血清培养液培养。接种后第4d首次半量换液,以后隔天换液,细胞融合达80%,结束原代培养,按1:3比例传代。定期观察,换液,传代。第五代细胞以5,000/cm~2接种在放置有经10μg/ml纤维粘连蛋白处理的盖玻片的六孔培养板中培养,培养液为DMEM/F12+ 摘 要 川%胎牛血清。待细胞融合达80%后,用DMEM+10%胎牛血清+lmM 0-ME+ 10“’M RA诱导 24h,0.01M PBS①H7.4)洗一遍。然后在无血清培养基中培养 sh巧。 期间相差显微镜下定时观察形态。采用免疫细胞化学分析细胞表型特点。半定量 RTPCR检测神经细胞特异基因表达叩actin作内对照人 电泳凝胶在凝胶图像分析 仪检测光密度,然后用SPSS10.0进行数据处理。 3.体外诱导人胎肝CD34“细胞向神经组织细胞分化研究 细胞培养:采用免疫磁珠法分离人胚胎肝CD34”细胞,接种在10七m塑料平M 或者培养瓶中(密度 5。* cells儿m、,以 DMEM0+10%胎牛血清培养液培养。 接种后第4d首次半量换液,以后隔天换液,细胞融合达80%,结束原代培养,按1: 3比例传代。定期观察,换液,传代。 p-ME+RA诱导分化:第五代细胞以 5*0/CIJ接种在放置有经 10 11 g/ml纤维粘 连蛋白处理的盖玻片的六孔培养板中培养,培养液为 DMEM/FIZ+10%胎牛血清。 待细胞融合达 80O后,用 DMEM+10o胎牛血清+lmM 0-ME+10“’M M诱导 24h, 0刀IM PBSoH7.4)洗一遍。然后在无血清培养基中培养shsd。期间相差显微镜下 定时观察形态。采用免疫细胞化学分析细胞表型特点。RT.PCR检测神经细胞特异基 因表达叩七ctin作内对照人电泳凝胶在凝胶图像分析仪检测光密度,然后用 SPSS刀 进行数扼处理。 p-ME+BHA诱导分化:第五代细胞以 5,000/cm’接种在放置有经 10 119/ml纤维粘 连蛋白处理的无菌盖玻片的六孔培养板中培养,培养液为 DMEM/FIZ+10%胎牛血 清。待细胞融合达 80%后。用 DMEM/F12+10%胎牛血清+lmM 5-ME处理24小 时;0刀IM PBS(PH7.4)洗一遍;在 DMEM/2%二甲基亚矾(DMSO)/0.2 mM BHA/ 2 mM卜ME无血清诱导培养基中培养 sd。期间相差显微镜下定时观察形态。采用免 疫细胞化学分析细胞表型特点。半定量RTPCR检测神经细胞特异基因表达叩{ctin 作内对照),电泳凝胶在凝胶图像分析仪检测光密度,然后用SPSS10刀进行数据处 理。 结果: 1.小鼠胎肝凯1细胞具有向造血细胞和神经组织细胞分化能力 移植胎肝h.广细胞的辐射实验组小鼠外周血各种血细胞数在5天后开始下 降,在 10天后开始上升,20天恢复至正常,均存活 6个月以上;而未移植凯-l+ 3_ 叮 摘 要 细胞的对照组小鼠20天内全部死亡。多聚酶链式反应(PCR)显示实验组小鼠外周 血细胞sry基因检测阳性,未移植对照组小鼠外周血细胞sry基因检测均为阴性;随 着移植时问的延长,移植小鼠外周血细胞sry基因的PCR扩增物量增加,2


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