小鼠胎肝Sca-1～+细胞及人胎肝CD34～+细胞向神经组织细胞分化研究

【摘要】： 目的： 了解胎肝干细胞在体内外是否具有向神经组织细胞分化的潜能，即可塑性，以进一步探索其分化规律；建立胎肝来源的细胞在体外向神经组织细胞分化模型。 拟从下面三个方面研究：小鼠胎肝Sca-1~+细胞在体内向神经组织细胞分化研究；体外诱导小鼠胎肝Sca-1~+细胞向神经组织细胞分化研究；体外诱导人胎肝CD34~+细胞向神经组织细胞分化研究。 材料方法： 1．观察小鼠胎肝Sca-1~+细胞移植后在受体鼠脑组织中的分化情况 利用快速的PCR扩增小鼠Y染色体特异的性别决定区蛋白基因(sex determing region protein,Sry)方法鉴定孕14.5d C57BL／6J胎鼠性别(总时间小于3.5h)，免疫磁珠法分离雄性胎鼠肝的Sca-1~+细胞，尾静脉注射Sca-1~+细胞(2.0×10~3个／小鼠)到致死剂量(10.0Gy)放射线照射的8-10周C57BL／6J雌性小鼠(辐射后4h内注射)，然后将实验小鼠饲养在无菌动物室。移植2、4、6月后断髓处死小鼠，取材制作石蜡或者冰冻切片。将受体小鼠脑组织作免疫组化和FISH双染色，以了解是否有供体来源的细胞、是否具有神经组织细胞表面标志特点。移植后5、10、15、20、60、120天断尾取血，作血象观察和sry基因PCR扩增，股骨骨髓切片作HE染色，以分析造血重建情况。 2．体外诱导小鼠胚胎肝Sca-1~+细胞向神经组织细胞分化研究 采用免疫磁珠法分离孕14.5d C57BL／6J胎鼠肝的Sca-1~+细胞，接种在10-cm塑料平皿或者培养瓶中(密度5×10~5 cells／cm~2)，以DMEM／F12+10％胎牛血清培养液培养。接种后第4d首次半量换液，以后隔天换液，细胞融合达80％，结束原代培养，按1：3比例传代。定期观察，换液，传代。第五代细胞以5,000／cm~2接种在放置有经10μg／ml纤维粘连蛋白处理的盖玻片的六孔培养板中培养，培养液为DMEM／F12+ 摘 要 川％胎牛血清。待细胞融合达80％后，用DMEM＋10％胎牛血清＋lmM 0－ME＋ 10“’M RA诱导 24h，0．01M PBS①H7．4）洗一遍。然后在无血清培养基中培养 sh巧。 期间相差显微镜下定时观察形态。采用免疫细胞化学分析细胞表型特点。半定量 RTPCR检测神经细胞特异基因表达叩actin作内对照人 电泳凝胶在凝胶图像分析 仪检测光密度，然后用SPSS10．0进行数据处理。 3．体外诱导人胎肝CD34“细胞向神经组织细胞分化研究 细胞培养：采用免疫磁珠法分离人胚胎肝CD34”细胞，接种在10七m塑料平M 或者培养瓶中（密度 5。＊ cells儿m、，以 DMEM0＋10％胎牛血清培养液培养。 接种后第4d首次半量换液，以后隔天换液，细胞融合达80％，结束原代培养，按1： 3比例传代。定期观察，换液，传代。 p－ME＋RA诱导分化：第五代细胞以 5＊0／CIJ接种在放置有经 10 11 g／ml纤维粘 连蛋白处理的盖玻片的六孔培养板中培养，培养液为 DMEM／FIZ＋10％胎牛血清。 待细胞融合达 80O后，用 DMEM＋10o胎牛血清＋lmM 0－ME＋10“’M M诱导 24h， 0刀IM PBSoH7．4）洗一遍。然后在无血清培养基中培养shsd。期间相差显微镜下 定时观察形态。采用免疫细胞化学分析细胞表型特点。RT．PCR检测神经细胞特异基 因表达叩七ctin作内对照人电泳凝胶在凝胶图像分析仪检测光密度，然后用 SPSS刀 进行数扼处理。 p－ME＋BHA诱导分化：第五代细胞以 5，000／cm’接种在放置有经 10 119／ml纤维粘 连蛋白处理的无菌盖玻片的六孔培养板中培养，培养液为 DMEM／FIZ＋10％胎牛血 清。待细胞融合达 80％后。用 DMEM／F12＋10％胎牛血清＋lmM 5－ME处理24小 时；0刀IM PBS（PH7．4）洗一遍；在 DMEM／2％二甲基亚矾（DMSO）／0．2 mM BHA／ 2 mM卜ME无血清诱导培养基中培养 sd。期间相差显微镜下定时观察形态。采用免 疫细胞化学分析细胞表型特点。半定量RTPCR检测神经细胞特异基因表达叩｛ctin 作内对照），电泳凝胶在凝胶图像分析仪检测光密度，然后用SPSS10刀进行数据处 理。 结果： 1．小鼠胎肝凯1细胞具有向造血细胞和神经组织细胞分化能力 移植胎肝h．广细胞的辐射实验组小鼠外周血各种血细胞数在5天后开始下 降，在 10天后开始上升，20天恢复至正常，均存活 6个月以上；而未移植凯－l＋ 3＿ 叮 摘 要 细胞的对照组小鼠20天内全部死亡。多聚酶链式反应（PCR）显示实验组小鼠外周 血细胞sry基因检测阳性，未移植对照组小鼠外周血细胞sry基因检测均为阴性；随 着移植时问的延长，移植小鼠外周血细胞sry基因的PCR扩增物量增加，2