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利用血红素进行生物化学分析的研究

张小芬  
【摘要】:由于血红素(heme)、含血红素蛋白质(heme-containing protein)在生物学、医学和环境科学等的研究和应用中倍受关注,是目前研究的热点之一。本课题在血红素研究的最新进展上,对血红素应用于生物化学分析进行了研究。 过氧化氢及血清中葡萄糖的检测在临床生物化学上具有重要意义。用惰性载体Sepharose 4B、微晶纤维素、人造沸石、琼脂糖等分别直接固定氯化血红素(hemin),装柱后应用于痕量过氧化氢的检测,同时利用葡萄糖氧化酶偶联模拟过氧化物酶法用于血清葡萄糖的检测,并比较它们的检测灵敏度。实验结果表明,以上几种载体经活化后均能很好地固定血红素,固定化的血红素装柱后保持稳定的催化过氧化氢的活性,检测灵敏度高。血红素在几种载体上检测灵敏度的大小为:Sepharose 4B>琼脂糖>微晶纤维素>人造沸石。本法操作简单且成本低,固定化的血红素反应柱可反复使用,能快速检测样品中的痕量过氧化氢及大量血样中的葡萄糖。 鉴于血清白蛋白分子的活泼性,在体外将牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)与氯化血红素以相同摩尔量结合制成血红白蛋白(hemalbumin),测定了其过氧化物酶活性。实验结果表明,血红白蛋白具有过氧化物酶特性,是一稳定而又活泼的分子。将血红白蛋白固定在已活化的Sepharose 4B载体上制成血红白蛋白柱子,偶联率达每克载体结合5.3mg血红白蛋白。将血红白蛋白柱子应用于测定痕量过氧化氢,显示正常、稳定的过氧化物酶活性,具极高测定灵敏度,能明显的测出低至3.63×10~(-7)mol/L浓度的过氧化氢。实验进一步探讨了人工合成的血红白蛋白用于催化H_2O_2氧化对甲基酚的反应体系,研究了含血红素白蛋白的过氧化物酶特征及其催化动力学特性,稳态速率法测定了米氏常数(K_m)、米氏速率(V_m)及反应级数等动力学参数。讨论了以甲基酚作为血红白蛋白氢供体底物的酶催化反应机理,确立了反应速率方程。实验发现血红白蛋白作为过氧化物酶(HRP)的替代物,其催化活性比氯化血红素、β-环糊精-氯化血红素(β-CD-hemin)等模拟过氧化物酶要高。 Sepharose 4B经环氧氯丙烷活化后直接固定氯化血红素制备亲和色谱柱,载体与氯化血红素的偶联率十分高,即每g溶胀的Sepharose 4B能固定高于0.25mg


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