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ADTZ密码子的优化以及重组表达质粒pNOA的构建

左振宇  
【摘要】:黄曲霉毒素是一类强致癌诱变剂,其毒性大,稳定性高,对人类和动物的危害较大,其中黄曲霉毒素B1是毒性最强的一种。该毒素的转化、去毒一直是受到关注的问题。本研究所长期从事黄曲霉毒素生物去毒转化的研究,筛选到一株产黄曲霉毒素解毒酶的菌株E-20。目前已运用基因工程技术获得了该黄曲霉毒素解毒酶基因的全长cDNA序列E123以及完整的开放阅读框序列ADTZ’。 为了实现ADTZ的高效表达,本研究所成功构建了重组质粒pSA。初步实现了其在毕赤酵母系统中的分泌表达,但该蛋白的表达量不高,不能满足进一步研究的需要,更没有达到工业化大量生产的要求。本文尝试根据毕赤酵母密码子偏好性优化黄曲霉毒素解毒酶基因的部分核苷酸序列,期望获得该基因在毕赤酵母中的高效表达。 本文把已优化的ADTZ编码区5’末端长936bp的序列分成了五段,分别命名为p3,Opt-A1,Opt-A2,Opt-A3,Opt-A4,它们的长度分别为219bp,270bp,192bp,183bp,159bp。利用Two-step DNA synthesis method先分别合成该五个片段,再把该五段序列拼接成一完整优化过的序列Opt-A’。最后把opt-A’与未优化的ADTZ-B拼接成完整的开放阅读框序列N-Opt-ADTZ。 将获得的优化序列N-Opt-ADTZ插入毕赤酵母分泌型载体pPICz α A中构建重组质粒,准备下一步蛋白表达的研究。


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