基于原子力显微术的抗菌肽杀菌机理和细胞表面受体识别的研究

【摘要】：本文第一部分基于原子力显微术，结合电子显微镜、荧光显微镜和荧光光谱仪等手段，系统研究了抗菌肽magainin 2和melittin对E.coli细胞的杀伤作用，并在此基础上对目前的抗菌肽杀菌机理进行了验证和补充，即抗菌肽对E.coli作用与抗菌肽的种类有关，也与抗菌肽的作用浓度相关。Magainin 2和melittin均是以“self-promoted uptake”方式穿越E.coli的外膜，到达细菌的内膜。Magainin 2在低肽浓度时，是以“环形孔”方式使内膜上形成通透的孔洞，引起跨膜电化学梯度的崩溃，膜内外离子和小分子物质互相通透。而在高肽浓度时，magainin 2可能是以“地毯”方式聚集在细胞膜的局部，环绕着菌体瞬间共同发力，将细胞“拦腰斩断”。Melittin在低浓度时也是以“环形孔”方式，使内膜上形成通透的孔洞，并且melittin优先与E.coli细胞两端内膜的负电荷磷脂结合，使一端变平、变薄、变软。在高肽浓度时，更多melittin分子优先聚集在细胞一端，迅速使这一端的细胞内膜渗透、裂解、死亡。 本文第二部分是关于免疫AFM技术。AFM在成像样品时存在的一个问题就是AFM缺乏特异性，不具备识别样品中特异组分的能力。我们借鉴免疫电镜技术，将免疫细胞化学技术和AFM原位扫描结合，以纳米金和量子点(QDs)为标记物，发展和推广了一种实验技术一免疫AFM技术(ImmunoAFM technology)。这种技术可以在纳米分辨率对细胞表面或细胞切片上的抗原或受体进行单分子、原位定位，操作简便且结果可靠，可大大拓宽AFM在生物学和医学领域的应用。更有价值的是，以QDs作为标记物，整合荧光显微镜和扫描探针显微镜(AFM或SNOM)，来研究生物大分子在细胞膜上的分布、定位及运动，必将在分子识别、信号传导以及细胞活化等领域大展身手。 本文第三部分采用生物相容性的高分子材料—多聚赖氨酸和透明质酸，利用生物素和链霉亲和素之间特异性结合力和层层自组装的方法制备了QDs的多层膜。AFM扫描结果显示，膜的表面均一，平整；紫外-可见吸收光谱显示随着膜层数的增加，吸收逐渐增强；荧光光谱也显示荧光强度随着层数增加也逐渐增强。这些结果表明多层膜中层与层之间结合良好，QDs在膜层中分布较好，没有发生