体外诱导大鼠骨髓及人胎盘间充质干细胞向多巴胺能样细胞分化

【摘要】： 目的: 1.体外培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞(rat bone marrow mesenchymal stem cells,rBMMSCs)和人胎盘间充质干细胞(human placenta mesenchymal stem cells,hPMSCs)。 2.探索rBMMSCs和hPMSCs是否具有向多巴胺能样细胞分化的潜能。 方法: 1.rBMMSCs和hPMSCs的分离、培养和鉴定 1.1.贴壁筛选法分离大鼠骨髓中间充质干细胞;消化、贴壁筛选法分离人胎盘中的间充质干细胞,以DMEM/F12培养基和10%的胎牛血清培养。 1.2.流式细胞仪检测hPMSCs表面抗原。 1.3.将rBMMSCs和hPMSCs向脂肪细胞分化,油红O染色观察诱导后的脂滴;将rBMMSCs和hPMSCs向成骨细胞分化,碱性磷酸酶判断诱导后的细胞是否具有成骨细胞的特征。 2.rBMMSCs和hPMSCs向多巴胺能样细胞诱导和鉴定 2.1.rBMMSCs向多巴胺能样细胞诱导 应用碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、抗坏血酸诱导rBMMSCs向多巴胺能样细胞分化。 2.2.hPMSCs向多巴胺能样细胞诱导 应用方案一(碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、抗坏血酸),方案二(碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、维甲酸、抗坏血酸、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)和方案三(碱性成纤维细胞生长因子、β-巯基乙醇、地塞米松、胰岛素、神经生长因子)诱导hPMSCs向多巴胺能样细胞分化。 2.3.RT-PCR检测rBMMSCs诱导前后神经巢蛋白基因、核受体相关因子-1基因、芳香族氨基酸脱羧酶基因和酪氨酸羟化酶基因的表达;检测hPMSCs诱导前后神经巢蛋白基因和酪氨酸羟化酶基因的表达。 2.4.免疫荧光染色检测rBMMSCs和hPMSCs诱导前后神经巢蛋白、神经核蛋白、多巴胺转运蛋白和酪氨酸羟化酶的表达。 2.5.ELISA法测定rBMMSCs和hPMSCs诱导前后培养上清和胞质多巴胺浓度。 结果: 1.rBMMSCs相关结果 (1)rBMMSCs原代培养一般10-14d;rBMMSC向成骨细胞诱导4周,细胞变为多边形,碱性磷酸酶染色胞质被染成棕褐色;rBMMSC向脂肪细胞诱导2周,细胞质中出现脂滴,油红O染成红色。(2)诱导向多巴胺能样细胞分化:RT-PCR显示未诱导的rBMMSCs仅表达β-actin,诱导后3d的细胞表达神经巢蛋白基因和核受体相关因子-1基因,诱导2周后的细胞表达神经巢蛋白基因、核受体相关因子-1基因、芳香族氨基酸脱羧酶基因和酪氨酸羟化酶基因;细胞免疫化学染色显示,诱导3d后的细胞胞质神经巢蛋白阳性,诱导7d后胞质酪氨酸羟化酶染色阳性,诱导10d后胞质多巴胺转运蛋白染色阳性;诱导后的细胞培养上清中有多巴胺分泌,诱导后的细胞裂解后胞质中有多巴胺。 2.hPMSCs相关结果 (1)hPMSCs原代培养一般21-25d;hPMSCs强表达CD44和CD29,不表达CD34、CD45,CD106和HLA-DR;hPMSCs向成骨细胞诱导4周,细胞变为多边形,碱性磷酸酶染色胞质被染成棕褐色;hPMSCs向脂肪细胞诱导4周,细胞质中出现脂滴,油红O染成红色。 (2)多巴胺能样细胞诱导后:RT-PCR显示未诱导的hPMSCs弱表达神经巢蛋白基因,诱导后的细胞表达神经巢蛋白基因和酪氨酸羟化酶基因;细胞免疫化学染色显示诱导后5d的细胞胞质神经巢蛋白染色阳性,诱导后7d的细胞胞质酪氨酸羟化酶染色阳性,诱导后10d后的细胞胞质多巴胺转运蛋白染色阳性;诱导后的细胞培养上清中有多巴胺分泌,诱导后的细胞裂解后胞质中有多巴胺。 结论: 1.人胎盘中MSCs能在体外培养扩增,胎盘MSCs表达CD44和CD29,不表达CD34、CD45、CD106及HLA-DR。 2.大鼠骨髓及人胎盘间充质干细胞在体外具有向脂肪细胞、成骨细胞分化的能力。 3.大鼠骨髓及人胎盘间充质干细胞在体外能诱导分化为多巴胺能样细胞,诱导的多巴胺能样细胞可以合成及分泌多巴胺。