体外诱导大鼠骨髓及人胎盘间质干细胞向胆碱能样神经元分化的实验研究

【摘要】： 目的: 培养扩增大鼠骨髓(bone marrow,BM)、人胎盘(placenta)间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs);探讨其定向诱导分化为胆碱能样神经元的有效条件。 材料方法: 1.间充质干细胞的分离培养 1.1大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养:使用全骨髓法将获取的骨髓直接种植到含10%FBs+DMEM/F12培养液的培养瓶中,置于37℃,体积分数为5%的CO2,饱和湿度培养箱中培养,每隔72h换液1次,7-10d首次传代。 1.2.人胎盘间充质干细胞的酶消化法分离培养:剪碎后先使用胶原酶Ⅱ消化后再用胰蛋白酶,反复吹打使成单细胞悬液和外植块混合物,100目滤网过滤收集单细胞,离心获得单个核细胞,悬浮于低糖DMEM培养基中,置37℃、5%CO2和100%湿度培养箱培养,随后每3～4d换液1次,经3～4周可见成纤维样细胞在瓶底汇合成片状。 2.间充质干细胞向胆碱能样神经元细胞分化诱导 2.1大鼠骨髓间充质干细胞向胆碱能样神经元细胞分化诱导:取2～4代MSCs,实验Ⅰ组:10%FBS(胎牛血清)诱导2d;换液为DMEM/F12加入bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)、2-ME(巯基乙醇)、RA(维甲酸)、NGF(神经生长因子)继续诱导8d。实验Ⅱ组:在Ⅰ组方案的基础上加入EGF(表皮生长因子)、Heparin继续诱导8d。空白对照组使用DMEM/F12培养液不加任何诱导剂连续培养10d,。 2.2人胎盘间充质干细胞向胆碱能样神经元细胞分化诱导:取4代胎盘间充质干细胞,实验Ⅰ组:10μg/LbFGF+10%FBS(胎牛血清)诱导2d;换液为DMEM/F12加入bFGF、2-ME、RA、NGF继续诱导19d。实验Ⅱ组:在Ⅰ组方案的基础上加入EGF(表皮生长因子)、Heparin继续诱导19d。空白对照组使用含DMEM/F12培养液不加任何诱导剂连续培养21d,。 3.倒置显微镜下观察诱导不同天数后的形态变化,SPSS13.0统计软件进行数据统计分析。 4.取诱导的MSCs,采用RT-PCR检测及凝胶电泳分析nestin,nurrl,chatmRNA的表达,均以β-actin作为内参照。 5.间接免疫荧光法检测Nestin,ChAT,NeuN,AchE阳性细胞表达。 6.流式细胞仪检测人胎盘间充质干细胞表面部分标志抗原成分及诱导分化后不同时间段的Nestin,ChAT,NeuN,AchE阳性细胞数量及向胆碱能样神经元细胞分化率 7.ELISA方法检测不同时间段的人胎盘间充质干细胞诱导分化后的上清液的终产物乙酰胆碱的表达含量 结果: 1.大鼠骨髓间充质干细胞向胆碱能样神经元细胞分化诱导结果:骨髓间充质干细胞诱导后形态学变化:诱导后细胞形态逐渐由长梭形变为圆形或椭圆形,突起形成,胞间或细胞与间质形成连接或神经球,胞浆内分泌颗粒增加。空白对照组第1、3、5、10天细胞形态变化率波动于1%左右,实验组变化率明显增高,差异有统计意义。诱导后的细胞高表达nestin、nurrl、chat mRNA,实验组间基因表达相对强度比较有统计差异(P＜0.01)。免疫荧光法检测显示,实验组Nestin,ChAT,NeuN,AchE阳性分化细胞率约50-80%,而空白对照组ChAT阳性分化细胞表达率仅约为1%。 2.人胎盘间充质干细胞向胆碱能样神经元细胞分化诱导结果:诱导后的胎盘间充质干细胞细胞形态变化与骨髓间充质干细胞类似。流式细胞术检测,人胎盘MSCs强表达透明质酸受体CD44和整合素家族成员CD29,阳性率分别为99.8%,99.7%;不表达造血干细胞标志CD34(4.8%)和CD45(0.9%),也不表达内皮细胞标志CD106(2.3%)。hPMSCs(人胎盘间充质干细胞)不表达HLA-DR(1.0%);14d诱导后的两实验组细胞均表达nestin、chatmRNA,实验Ⅰ组(FMRN组)Nestin、AchE、ChAT,表达阳性率分别为29.7%,85.8%,24.5%;实验Ⅱ组(FMRENH组)分别为76.3%,98.2%,10.4%,阴性对照组分别为1.9%,10.8%,4.5%。ELISA方法检测示,对照组第4代胎盘MSCs、实验Ⅰ、Ⅱ组诱导1、2、3周的上清乙酰胆碱浓度分别为0±4.6nmol/1、0±4.7 nmol/1、20±9.4 nmol/1:638.9±7.9 nmol/1、393.6±10.3nmol/1、905.1±10.1 nmol/1:39.2±26.6 nmol/1、82.1±23.2 nmol/1、234.9±19.2 nmol/l。组间比较差异明显P＜0.01 结论: 1.骨髓间充质干细胞、人胎盘间充质干细胞能在体外培养扩增,并可以在诱导剂作用下,在体外诱导分化为具有合成及释放降解乙酰胆碱能力的胆碱能样神经元细胞,实验Ⅰ组有较高的分化率。 2.人胎盘MSCs强表达CD44、CD29;不表达CD34、CD45(0.9%)、CD106、HLA-DR