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微藻产氢研究及2种绿藻氢酶基因的克隆

贺立静  
【摘要】: 能源需求的不断增长与日益严重的环境污染之间存在着尖锐的矛盾,寻找清洁的替代能源已成为一项迫切的课题。氢作为一种清洁的能源,其研究开发已经成为能源研究的重要方向。微藻产氢是生物制氢领域最有应用前景的研究方向之一。 本论文对8种绿藻:羊角月牙藻(Selenastrum capricormutum)、纤维藻(Ankistrodesmus sp.)、雪衣藻(Chlamydomonas nivalis)、斜生栅藻(Scenedesmusobliqnus)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、绿藻1969(Chlamydomonas augustae)、小球藻(Chlorella vnlgaris)、蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)和7种蓝藻:水华微囊藻(Microcystis flos-aquae)、具缘微囊藻(Microcystis marginata)、铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)、束丝藻(Aphanizomenon sp.)、假鱼腥藻(Pseudanabaena sp.)、丝藻(Ulothrix sp.)和颤藻(Oscillatoria sp.)的产氢能力进行了测定;研究了其中6种绿藻:雪衣藻、斜生栅藻、莱茵衣藻、绿藻1969、小球藻和蛋白核小球藻在有硫培养液(TAP培养液)和无硫培养液(TAP-S培养液)的产氢特征,测定了绿藻对不同产氢条件下的光合作用生理响应;研究和分析了蛋白核小球藻在pH(5.0-8.0)的TAP和TAP-S培养液内产氢能力以及与光合作用的关系;对雪衣藻和绿藻1969的氢酶基因进行了克隆和分析,以期为今后氢酶的改造或修饰,提高其耐氧性和产氢活性的研究提供基础。研究结果如下: (1)采用BG11_0培养基,将藻液经过3 h暗适应,然后照光培养1 h,结果显示①绿藻羊角月牙藻和纤维藻经3 h暗适应和光照培养1 h两个阶段后均未检测到氢气,而莱茵衣藻、绿藻1969、小球藻、蛋白核小球藻在两个阶段均可检测到有氢气产生;雪衣藻在暗适应3h后未检测到氢气,光照1h后,可以检测到氢气产生;斜生栅藻在暗适应3h后可产生氢气,而光照1h后,则吸收暗适应时产生的部分氢气。②蓝藻中的水华微囊藻在上述两个阶段后未检测到氢气产生;缘微囊藻、束丝藻、假鱼腥藻、丝藻和颤藻暗适应3 h后可检测到氢气产生,而光照1h后,则吸收暗适应时产生的氢气。铜绿微囊藻在两个阶段均可检测到有氢气产生。 (2) 6种产氢绿藻在TAP和TAP-S培养液中的产氢以及叶绿素荧光的研究结果显示:①暗适应24 h,6种绿藻在TAP和TAP-S培养液中均可产氢。②在光照不同培养条件时,莱茵衣藻在TAP-S培养液内产氢最多,120 h时总产氢量达到4.77 ml,产氢速率0.63 ml·h~(-1)·L~(-1),是蛋白核小球藻在两种培养条件下产氢总量的10倍左右,是其它藻产氢总量的100倍左右。③在TAP培养液内光照培养时,6种绿藻的F_v/F_m值和φ_(PSII)值与初始值相比都有不同程度的升高,表明这6种绿藻在TAP培养液中的原初光能转化效率和光化学反应效率均有提高,可知在TAP培养液中绿藻产氢需要的无氧环境是由绿藻细胞生长速度快,呼吸作用强形成的局部缺氧环境。在TAP-S培养液内光照培养时,6种绿藻F_v/F_m值和φ_(PSII)值与初始值相比都有不同程度的降低,可知6种绿藻在TAP-S培养液中,原初的光能转化效率和光化学反应效率均有不同程度的下降,使氧气含量减少,形成无氧环境,促使氢气产生。 (3)采用不同pH(5.0-8.0)的TAP和TAP-S培养液,对蛋白核小球藻进行光照产氢实验,结果显示:在持续光照(165μmol·m~(-2)·s~(-1))条件下,有硫培养液(TAP培养液)内最高产氢速率和总产氢量出现在pH 7.0,分别是0.62 ml·h~(-1)·L~(-1)和1.39 ml。。无硫培养液(TAP-S培养液)内叶绿素a含量、F_v/F_m值及φ_(PSII)值变化表明蛋白核小球藻生长明显受抑制,形成的无氧环境持久,故产氢持久,总体产氢量比有硫培养液内高。pH 5.5的培养液内藻的产氢速率和总产氢量最大,分别是0.78 ml·h~(-1)·L~(-1)和10.98 ml。 (4)对雪衣藻和绿藻1969的细胞进行无氧条件诱导,收集藻细胞提取总RNA,采用RT-PCR与RACE-PCR相结合方法,克隆两个绿藻的全长hydA基因。两种绿藻的hydA基因序列全长均为1176 bp,核苷酸序列同源性高达99.8%。两种测试藻与绿藻Chlorellafusca的核苷酸同源性为85%,与斜生栅藻的核苷酸同源性为76%。hydA基因编码的氢酶蛋白,由392个氨基酸组成,其氨基酸同源性达100%。


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