酰基化葡萄糖HSV活性及其作用机制初步研究

【摘要】： 目的: 研究酰基化葡萄糖抗单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV)活性及其构效关系,并对其作用机制做初步探讨,为抗病毒作用机制的深入研究奠定基础,为开发新型抗HSV药物提供理论依据。 方法: (1)MTT(四甲基偶氮唑蓝)法检测酰基化葡萄糖对Vero细胞的毒性作用。 (2)细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)法与空斑减数实验(plaque redction assay,PRA)检测酰基化葡萄糖抗HSV-1、HSV-2活性。 (3)根据酰基化葡萄糖结构类似物的抗病毒活性结果,探讨其构效关系。 (4)对于其中代表化合物C58(1,2,4,6-四-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖)抗HSV-1作用机制的研究,首先用PRA法检测其对HSV-1的直接灭活作用、对病毒吸附与穿入宿主细胞过程的影响,以及不同加药时间药物对病毒的抑制作用。 (5)实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测C58对HSV-1立即早期基因(U_L54)、早期基因(U_L52)及晚期基因(U_L27)表达的影响。 (6)Real-time PCR检测C58对HSV-1DNA复制的影响。 (7)激光共聚焦显微镜观察C58作用后病毒糖蛋白gB合成的变化。 结果: (1)16种酰基化葡萄糖中除C8(nobotarin D)外在毒性测定中未对Vero细胞表现出毒性作用,其半数毒性浓度(50%toxic concentration,TC_(50))均大于200μg/ml。 (2)除C78(1-O-咖啡酰基-β-D-葡萄糖)外,各酰基化葡萄糖均对HSV-1与HSV-2感染引起的细胞病变有不同程度的抑制作用。C58表现出最好的抗病毒效果,其对HSV-1与HSV-2的半数抑制浓度(50%inhibiting concentration,IC_(50))分别为8.77μg/ml与19.50μg/ml,选择系数(therapeutic index,TI)分别大于23.44与10.26。 (3)根据化合物构效比较结果,推测没食子酰基作为功能基团存在,其取代数量直接影响酰基化葡萄糖的抗HSV活性,且R1位酰基化对于发挥更好的抗HSV起重要作用。当以O-2-O-3和/或O-4-O-6方式与葡萄糖骨架连接时,HHDP基团对抗HSV活性的影响类似于两个没食子酰基的作用。咖啡酰基对酰基化葡萄糖抗HSV的增强作用不及没食子酰基。 (4)PRA法对C58的作用方式进行检测,结果表明C58可直接灭活HSV-1,使病毒不能正常吸附、穿入宿主细胞;从病毒感染开始至病毒释放,25μg/mlC58均可有效发挥抗病毒作用。 (5)C58作用后HSV-1立即早期基因(U_L54)表达水平为病毒对照组的94.28%,而早期基因(U_L52)与晚期基因(U_L27)表达水平均明显降低,分别为病毒对照组的40.91%与23.16%。 (6)C58作用后HSV-1 DNA复制受明显抑制,其拷贝数为病毒对照组的4.7%。 (7)C58作用后HSV-1糖蛋白gB的合成受抑制,其在胞内的含量与病毒对照相比明显降低。 结论: 没食子酰基作为功能基团对于酰基化葡萄糖发挥抗病毒活性起重要作用,其中C58抗HSV-1的作用机制,在胞外主要表现为直接灭活病毒,在胞内为抑制病毒基因表达、DNA复制与病毒蛋白的合成,其有效作用时间贯穿病毒复制周期始终。