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1α,25-二羟维生素D_3对人输卵管上皮细胞calbindin-D28k表达调控的研究

张纯  
【摘要】: 目的: 1.研究月经周期不同时期人输卵管黏膜上皮维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)蛋白及其mRNA的表达与变化,阐明人输卵管组织中是否存在VDR表达及其表达状况。 2.检测输卵管妊娠病理状态下人输卵管黏膜上皮VDR蛋白的表达及其变化,分析人输卵管黏膜上皮VDR蛋白表达与输卵管妊娠发病的可能关系。 3.体外培养人输卵管上皮细胞,观察1α,25-二羟维生素D_3(1α,25-dihydroxyvitamin D_3,1α,25-(OH)_2D_3)对人输卵管上皮细胞增殖的影响。 4.检测1α,25-(OH)_2D_3对体外培养人输卵管上皮细胞VDR、钙结合蛋白calbindin-D28k(CaBP-D28k)mRNA及其蛋白表达的影响,分析1α,25-(OH)_2D_3对人输卵管上皮细胞VDR、CaBP-D28k表达可能的调控作用,探讨1α,25-(OH)_2D_3调节人输卵管上皮细胞CaBP-D28k表达可能的作用机制。 方法: 1.应用免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)法和逆转录聚合酶链反应(reversetranscription polymerase chain reaction,RT-PCR)法检测人输卵管黏膜上皮VDR蛋白及其mRNA的表达。 2.应用IHC法检测输卵管妊娠病理状态下,种植部位和非种植部位人输卵管黏膜上皮VDR蛋白的表达。 3.应用机械法结合差速贴壁原理获取并体外培养人输卵管上皮细胞,免疫细胞化学(immunocytochemistry,ICC)法鉴定上皮细胞纯度,建立人输卵管上皮细胞的体外培养体系。应用噻唑兰(3.(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)比色法检测1α,25-(OH)_2D_3对体外培养人输卵管上皮细胞增殖的影响。 4.应用RT-PCR法和免疫印迹(Western blot,WB)法检测1α,25-(OH)_2D_3对体外培养人输卵管上皮细胞VDR、CaBP-D28k mRNA及其蛋白表达的影响。 结果: 1.人输卵管黏膜上皮VDR蛋白及VDR mRNA的表达 人输卵管黏膜上皮可检测到VDR蛋白及其mRNA表达。VDR蛋白主要表达于人输卵管上皮细胞的细胞核内,部分间质平滑肌细胞核内亦可见阳性染色。相同时期各不同部位人输卵管上皮细胞VDR蛋白表达无明显差别(P>0.05),随月经周期变化,各不同部位输卵管上皮细胞VDR蛋白表达发生改变,在增生早期和分泌中晚期较低,与之比较,在增生中晚期和分泌早期其表达明显增高(P<0.01),至分泌早期达最高值。壶腹部人输卵管黏膜上皮组织VDR mRNA表达在增生早期和分泌中晚期较低,在增生中晚期和分泌早期明显增高(P<0.01)。 2.输卵管妊娠病理状态下人输卵管黏膜上皮VDR蛋白的表达 输卵管妊娠病理状态下,种植部位和非种植部位人输卵管黏膜上皮均可检测到VDR蛋白阳性表达。VDR蛋白阳性表达于输卵管上皮细胞的细胞核内,部分间质平滑肌细胞核内亦可见阳性染色。种植部位人输卵管上皮细胞VDR蛋白表达较低,与之比较,非种植部位输卵管上皮细胞VDR蛋白表达明显增高(P=0.017,P<0.05)。 3.人输卵管上皮细胞培养、鉴定及1α,25-(OH)_2D_3对其细胞增殖的影响 应用机械法结合差速贴壁原理获取并体外培养的人输卵管上皮细胞均可生长并传代,处于卵泡期或黄体期的人输卵管上皮细胞体外生长状况无显著差异。细胞角蛋白ICC染色结果显示,原代培养及传代第1-3次的细胞,其染色阳性细胞占培养细胞总数的90%以上,可用于后面的实验。以不同浓度1α,25-(OH)_2D_3处理体外培养人输卵管上皮细胞不同时间,人输卵管上皮细胞吸光度值(A_(490))无明显变化(P>0.05)。 4.1α,25-(OH)_2D_3对人输卵管上皮细胞VDR、CaBP-D28k mRNA及其蛋白表达的影响以不同浓度1α,25-(OH)_2D_3处理体外培养人输卵管上皮细胞12 h,与空白对照、酒精对照组比较,10~(-7)mol/L 1α,25-(OH)_2D_3组细胞VDR、CaBP-D28k mRNA表达均明显升高(P<0.05或0.01),且10~(-8)mol/L 1α,25-(OH)_2D_3组细胞VDR、CaBP-D28k mRNA表达量之间呈正相关(r=0.968,P=0.032,P<0.05)。 以10~(-7)mol/L 1α,25-(OH)_2D_3处理体外培养人输卵管上皮细胞不同时间,与对照组(0 h)比较,干预6 h、12 h组细胞VDR、CaBP-D28k mRNA表达均显著升高(P<0.05或0.01),且处理0 h、3 h、6 h、24 h、48 h组细胞VDR、CaBP-D28k mRNA表达量之间呈正相关(r=0.968,0.977,0.973,0.976,0.993,P<0.05或0.01)。WB检测结果显示,与对照组(0 h)比较,干预24 h、48 h组细胞VDR、CaBP-D28k蛋白表达均明显升高(P<0.05或0.01),且各组细胞VDR、CaBP-D28k蛋白表达量之间均呈正相关(r=0.981,0.982,0.962,0.984,0.985,0.977,P<0.05)。 结论: 1.人输卵管黏膜上皮存在VDR蛋白及其mRNA表达,在增生中晚期和分泌早期其表达明显增高,且具有周期性变化。 2.输卵管妊娠病理状态下,种植部位和非种植部位人输卵管黏膜上皮VDR蛋白表达不同。与种植部位比较,非种植部位人输卵管黏膜上皮VDR蛋白表达显著增高。 3.机械法结合差速贴壁原理可获取纯度较高的人输卵管上皮细胞,1α,25-(OH)_2D_3不影响体外培养人输卵管上皮细胞的增殖。 4.在体外培养条件下,1α,25-(OH)_2D_3可能通过VDR上调人输卵管上皮细胞CaBP-D28kmRNA及其蛋白的表达。


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