脓毒症预后预测指标的筛选及小檗碱和育亨宾合剂对它们的影响

【摘要】： 目的: 分析脓毒症情况下淋巴细胞凋亡水平、炎症细胞因子水平、免疫功能状态与病情严重程度和预后的关系;探讨它们作为预测脓毒症预后指标的可行性;进一步利用动物实验观察小檗碱和育亨宾合剂对脓毒症和上述相关指标的影响。 材料与方法: 第一章观察脓毒症患者外周血淋巴细胞凋亡、炎症细胞因子水平和机体免疫功能状态的变化及其临床意义 收集广东省人民医院综合危重病监护病房(GICU)于2007年6月至2007年12月收治的脓毒症患者26例,据器官功能受损情况,分为脓毒症非MODS(multiple organ disfunctionsyndrome)组和脓毒症致MODS组;2007年7月门诊健康体检者15例为正常对照组。抽取外周静脉血4mL,流式细胞仪检测淋巴细胞凋亡率、CD4~+/CD8~+比值、Th1/Th2比值和CD14~+单核细胞人类白细胞抗原-DR(HLA-DR)的表达率;用酶联免疫吸附法(EnzymeLinked Immunosorbent Assay,ELISA)测定血浆细胞色素C(Cytochrome-c,Cyt-c)、白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素18(interleukin-18,IL-18)、白细胞介素27(interleukin-27,IL-27)、干扰素γ(interferonγ,IFNγ)、高迁移率族蛋白1(high mobilitygroup B1,HMGB-1)水平;记录感染相关器官衰竭评分系统(Sepsis-related Organ FailureAssessment,SOFA)评分和急性生理学与慢性健康状况评分系统Ⅱ(Acute Physiology andChronic Health EvaluationⅡ,APACHEⅡ)评分;比较组间相关指标的差异,并将上述检测指标与APACHEⅡ、SOFA评分进行相关分析,观察其变化与病情轻重和预后的关系。 第二章预测脓毒症患者预后的相关指标筛选 根据2001年国际脓毒症会议制定的关于脓毒症诊断新标准制定入选标准,剔除入院时已发生或入院后3天内发生MODS和符合其它排除标准的患者。对研究对象进行常规治疗,观察患者的病情发展变化及转归。根据患者7天内病情发展变化将研究对象分为两个组:脓毒症非MODS组、脓毒症致MODS组。所有入选患者随访28天,根据随访的结果分成死亡组和存活组;利用APACHEⅡ和SOFA评分标准对入选对象一周内每天进行一次APACHEⅡ和SOFA评分;用ELISA法测定入选对象入选第0、1、3、7天外周血血浆Cyt-c、IL-6、IL-8、IL-18、IL-27、IFNγ和HMGB-1水平;流式细胞仪检测淋巴细胞凋亡率、CD4~+/CD8~+比值、Th1/Th2比值和HLA-DR表达率。比较MODS组与非MODS组之间,死亡组与生存组之间相关指标的差别,观察其变化与病情轻重、预后的关系,将所有检测的指标单因素分析有统计学意义者绘制预测预后的ROC曲线,评价其预测功能,多因素分析建立预测预后的判别方程。 第三章不同严重程度脓毒症小鼠淋巴细胞凋亡和血清IL-18的变化及其预后分析 实验分3批进行:①32只昆明小鼠随机分成假手术对照(control)组(n=10)、轻度脓毒症(CLP No.9)组(n=11)和重度脓毒症(CLP No.16)组(n=11),用盲肠结扎穿孔(CLP)法制作脓毒症模型,观察比较三组小鼠7天死亡率的差异;②26只昆明小鼠随机分成假手术对照(control)组(n=8)、轻度脓毒症(CLP No.9)组(n=10)和重度脓毒症(CLP No.16)组(n=8),比较各组造模后20h肝、肺、肾相关功能指标和血常规指标的组间差异;③30只昆明小鼠随机分成假手术对照(control)组(n=10)、轻度脓毒症(CLP No.9)组(n=10)和重度脓毒症(CLP No.16)组(n=10),测定造模后20h各组血清Cyt-c、IL-18水平,脾脏淋巴细胞caspase-3活性和淋巴细胞凋亡率。 第四章小檗碱和育亨宾合剂对脓毒症小鼠预后及脾脏淋巴细胞凋亡和血清IL-18变化的影响 实验分2批进行:①43只昆明鼠随机分成sham+双蒸水组(control)、CLP+双蒸水(CLP)组、CLP+Ber+Y和sham+Ber+Y组(Ber+Y),观察比较各组小鼠14天的死亡率;②32只昆明鼠随机分成sham+双蒸水组(control),、CLP+双蒸水组(CLP)和CLP+Ber+Y组,检测造模后20h各组血清Cyt-c、IL-18水平,脾脏淋巴细胞caspase-3活性和脾淋巴细胞凋亡率。 应用SPSS 13.0统计包软件,对所有数据均进行正态性检验,正态分布的计量资料以均数±标准差(?)±s)表示,三组均数比较采用方差分析(方差不齐使用Brown-Forsythe近似方差分析,多重比较使用Dunnett's T3法),两组均数比较采用,检验,相关分析用Pearson相关分析:非正态分布的计量资料以中位数(四分位间距)【Md(IQR)】表示,采用非参数检验的独立样本检验,相关分析用Spearman秩相关分析,生存时间比较使用Kaplan-Meier法,绘制生存曲线;列联表资料用x~2检验,多组间两两比较采用x~2分割法;非参数检验多个独立样本两两比较采用Nemenyi检验,P＜0.05时为差异有统计学意义。 结果: 第一章脓毒症患者淋巴细胞凋亡、炎症细胞因子水平和机体免疫功能状态的变化及其临床意义 1、脓毒症患者淋巴细胞凋亡率和血浆Cyt-c水平显著高于正常对照组,且脓毒症致MODS组高于脓毒症非MODS组;HLA-DR表达率显著低于琥常对照组;脓毒症致MODS组CD4~+/CD8~+低于脓毒症非MODS组;脓毒症致MODS组血浆IL-18水平显著高于正常对照组,与脓毒症非MODS组无显著差别;IL-27水平脓毒症非MODS组和脓毒症致MODS组显著高于正常对照组,但脓毒症非MODS组和脓毒症致MODS组之间无统计学差异;脓毒症致MODS组IFNγ水平显著高于其余两组。 2、APACHEⅡ评分与淋巴细胞凋亡率、血浆Cyt-c、IL-18、IL-27、IFNγ水平,SOFA评分与淋巴细胞凋亡率、血浆Cyt-c、IL-6、IL-18、IL-27、IFNγ水平均存在显著正相关,APACHEⅡ评分与HLA-DR%、Th1/Th2,SOFA评分与HLA-DR%、Th1/Th2均存在显著负相关;淋巴细胞凋亡率、血浆Cyt-c与IL-18、IL-27、IFNγ在显著正相关,与HLA-DR%存在显著负相关(P＜0.05)。 第二章预测脓毒症患者预后的相关指标 1、7天内发生MODS的预测指标: 脓毒症致MODS组入选第0天IL-8、心率、血糖、血Na~+水平和格拉斯哥(GCS)评分显著高于脓毒症非MODS组、淋巴细胞计数显著低于脓毒症非MODS组(P＜0.05),第1天IL-18、IFNγ和Cr,第3天IL-6和IFNγ均显著高于脓毒症非MODS组(P均＜0.05),第2天PaO_2/FiO_2、第3天HLA-DR%显著低于脓毒症非MODS组(P＜0.05),第0-3天APACHEⅡ评分和第0-3天SOFA评分均显著高于脓毒症非MODS组(P均＜0.05)。入选第0天IL-8、心率、血糖、血Na~+水平、GCS评分、淋巴细胞计数,第1天IL-18、IFNγ,第2天PaO_2/FiO_2,第3天IL-6、IFNγ和HLA-DR%,第0-3天APACHEⅡ评分和第0-3天SOFA评分可预测7天内MODS(P均＜0.05);各指标整体预测效能以ROC曲线下面积衡量,从大到小依次为:APACHEⅡ(3d)、APACHEⅡ(2d)、SOFA(1d)、SOFA(3d)、APACHEⅡ(0d)、IL-6(3d)、APACHEⅡ(1d)、IFNγ(3d)、SOFA(0d)、SOFA(2d)、IL-18(1d)、IFNγ(1d)、IL-8(0d)、HLA-DR%(3d)、PaO_2/FiO_2(2d);ROC曲线分析最佳截断点时预测的准确度(以YI衡量)从大到小依次为:APACHEⅡ(3d)、APACHEⅡ(2d)、SOFA(1d)、IL-18(1d)、IL-6(3d)、IFNγ(1d)、IFNγ(3d)、SOFA(3d)、SOFA(2d)、APACHEⅡ(0d)、SOFA(0d)、APACHEⅡ(1d)、IL-8(0d)、PaO_2/FiO_2(2d)、HLA-DR%(3d)。取24h内单因素分析有统计学意义者建立对7天内MODS进行预测的判别函数,血小板计数(PC),心率,GCS,IL-18,IL-8和淋巴细胞计数进入判别方程:Y(0)=1.100×10~(-2)x_1+0.451x_2+1.910x_3+5.489×10~(-2)x_4-0.166x_5+2.322x_6-38.541;Y(1)=-4.635×10~(-3)x_1+0.542x_2+1.574x_3+5.675×10~(-2)x_4.-0.155x_5+1.162x_6-37.148【Y(0)代表未发生MODS,Y(1)代表发生MODS,x_1-PC(0d),x_2-HR(0d),x_3-GCS(0d),x_4-IL-18(1d),x_5-IL-8(0d),x_6-lymphocytecount(0d)】,判别准确度为82.7%,灵敏度=86%,特异度=79%,Youden指数=65%。该模型预测7天内MODS发生,其准确度高,优于上述单一指标的单因素分析及APACHEⅡ评分和SOFA评分分析结果。 2、28天内生存的预测指标: 死亡组入选第0天Cyt-c显著高于存活组,淋巴细胞计数、HLA-DR%和Th1/Th2显著低于存活组(P均＜0.05),第1天淋巴细胞凋亡率、IL-18均高于存活组,PaO_2/FiO_2低于存活组(P均＜0.05),第3天HMGB1高于存活组(P＜0.05),第3天HLA-DR%和Th1/Th2显著低于存活组(P均＜0.05),第0-7天APACHEⅡ评分和第1-7天SOFA评分均高于存活组(P均＜0.05);第01天Cyt-c、淋巴细胞计数、HLA-DR%和Th1/Th2,第1天淋巴细胞凋亡率、PaO_2/FiO_2和IL-18,第3天HMGB-1、HLA-DR%和Th1/Th2以及第0-7天APACHEⅡ评分和第1-7天SOFA评分可以预测28天生存情况(P均＜0.05)。各检测指标整体预测效能(以ROC曲线下面积衡量)和APACHEⅡ评分、SOFA评分比较,从大到小依次为:淋巴细胞凋亡率(1d)、SOFA(1d)、APACHEⅡ(3d)、APACHEⅡ(2d)、APACHEⅡ(4d)、APACHEⅡ(7d)、APACHEⅡ(1d)、APACHEⅡ(5d)、HLA-DR%(0d)、APACHEⅡ(6d)、SOFA(4d)、HLA-DR%(3d)、SOFA(2d)、Cyt-c(0d)、SOFA(3d)、SOFA(5d)、IL-18(1d)、HMGB1(3d)、APACHEⅡ(0d)、Th1/Th2(0d)。ROC曲线分析最佳截断点时预测的准确度(以Y1衡量)和APACHEⅡ评分、SOFA评分比较,从大到小依次为:淋巴细胞凋亡率(1d)、APACHEⅡ(1d)、APACHEⅡ(7d)、SOFA(1d)、HLA-DR%(0d)、IL-18(1d)、APACHEⅡ(3d)、APACHEⅡ(2d)、HLA-DR%(3d)、SOFA(4d)、APACHEⅡ(4d)、APACHEⅡ(5d)、HMGB1(3d)、SOFA(3d)、APACHEⅡ(0d)、Cyt-c(0d)、APACHEⅡ(6d)、SOFA(5d)、SOFA(2d)、Th1/Th2(0d)。取24h内单因素分析有统计学意义者建立预测28天生存情况的判别函数,入选24h内淋巴细胞凋亡率和HLA-DR进入判别方程:Y(0)=0.456x_1+0.315x_2-24.587;Y(1)=0.392x_1+0.431x_2-22.430【Y(0)代表存活,Y(1)代表死亡,x_1-HLA-DR 0d,x_2-rate of lymphocyte apoptosis1d】。判别结果分析:准确率=(13+28)/52=78.8%,灵敏度=77%,特异度=80%,Youden指数=57%。该模型预测28天生存情况,其准确度较高,优于上述单一指标单因素分析及APACHEⅡ评分和SOFA评分分析结果。 第三章不同严重程度脓毒症小鼠淋巴细胞凋亡和IL-18的变化及其预后分析 1、造模后观察7天死亡率,对照组168h无一例死亡,平均生存时间＞168h,轻度CLP组平均生存时间112.36±16.78h,重度CLP平均生存时间85.10±18.90h,整体比较三组生存时间差异有统计学意义(x~2=14.472,P＜0.01);重度CLP与轻度CLP组比较,第7天的生存率没有显著性差异。 2、三组造模后20h器官功能变化显示:轻、重脓毒症模型组丙氨酸氨基转移酶(ALT)和门冬氨酸氨基转移酶(AST)显著高于对照组(P均＜0.05);三组间肺湿重/干重比整体水平比较差异有统计学意义(P＜0.05),重度脓毒症组肺湿重/干重比显著高于对照组和轻度脓毒症组(P均＜0.05);尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)和总胆红素(TB)各组间比较差异无统计学意义(P均＞0.05)。 3、轻、重脓毒症模型组20h脾脏淋巴细胞、T淋巴细胞、CD4~+T淋巴细胞凋亡率明显高于对照组,但轻、重脓毒症模型组之间没有显著差别。轻、重脓毒症模型组外周血淋巴细胞计数明显低于对照组,但轻、重脓毒症模型组之间没有显著差别。外周血IL-18水平,三组间未见明显差别。外周血淋巴细胞计数与脾脏淋巴细胞、T淋巴细胞、CD4~+T淋巴细胞凋亡率均存在显著负相关关系(P均＜0.05),其中外周血淋巴细胞计数与脾脏CD4~+T淋巴细胞凋亡率相关关系最为密切。 4、肝功酶与脾脏淋巴细胞、T淋巴细胞、CD4~+T淋巴细胞凋亡率和Caspase-3活性存在显著正相关(P均＜0.05);肝功酶与外周血淋巴细胞计数呈负相关(P均＜0.05);脾脏淋巴细胞凋亡与肺湿重/干重比无相关关系。 第四章小檗碱和育亨宾合剂对脓毒症小鼠预后及淋巴细胞凋亡和IL-18变化的影响 1、造模后观察14天死亡率:CLP+Ber+Y组小鼠14天生存率明显高于CLP组; 2、CLP+Ber+Y组淋巴细胞、T淋巴细胞凋亡率低于CLP组,外周血IL-18高于CLP组,但差异尚无统计学意义(P均＞0.05),而CD4~+T淋巴细胞凋亡率显著低于CLP组,差异有统计学意义(P＜0.05)。 结论: 1、外周血淋巴细胞凋亡率,血浆Cyt-c、IL-18、IL-27、IFNγ水平,Th1/Th2比值、HLA-DR表达率和CD4~+/CD8~+比值均可在一定程度上反映脓毒症患者病情严重程度和预后; 2、病例入选24h内血小板计数(PC),心率,GCS,IL-18,IL-8水平和淋巴细胞计数建立的判别方程可预测7天内MODS的发生,预测总准确率为82.7%;入选24 h内淋巴细胞凋亡率和HLA-DR建立的判别方程可预测28天的生存情况,预测总准确率为78.8%; 3、动物实验证实,脾脏淋巴细胞凋亡与血清肝功酶水平之间存在显著正相关,与肺湿重/干重比无相关关系。外周血淋巴细胞计数与脾脏淋巴细胞、T淋巴细胞、CD4~+T淋巴细胞凋亡率均存在显著负相关关系。轻、重脓毒症模型组CLP后20h淋巴细胞及其亚群的凋亡率没有显著差别,两组第7天的死亡率也没有显著差别。 4、小檗碱和育亨宾合剂能抑制脓毒症小鼠脾脏淋巴细胞特别是CD4~+T淋巴细胞凋亡,并显著降低脓毒症小鼠的死亡率。 这些结果说明淋巴细胞凋亡在脓毒症患者预后预测和疗效评价中具有重要价值。