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TAT-PDX1蛋白诱导的人胎肝间充质干细胞分化为胰岛β样细胞的研究

姜铧  
【摘要】: 目的: 探讨人胎肝来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells derived fromhuman fetal liver,hFLMSCs)的分离和特性;用转录子TAT-PDX1(trans activitortranscription-pancreatic duodenal homeoboxl)蛋白诱导其分化为胰岛β样细胞能力,以及分化细胞表达胰岛素定性和治疗NOD/SCID鼠糖尿病的效果。 方法: 取12-20周流产胎儿肝脏,剪切、吹打胎肝组织获取肝细胞悬液,通过二步离心收集肝非实质细胞,再用羟乙基淀粉沉淀红细胞,从而使有核细胞得到富集。接种、培养上述细胞,利用细胞差速贴壁生长的特性纯化hFLMSCs。流式细胞仪检测hFLMSCs的细胞周期和表面标志,对P10代及冻存半年后复苏的hFLMSCs进行染色体分析,用经典方法诱导hFLMSCs向脂肪细胞、成骨细胞分化。 用TAT-PDX1蛋白为主的方案体外诱导P3 hFLMSCs分化为胰岛β细胞,观察细胞形态变化,用RT-PCR方法检测基因的表达情况,用双硫腙染色,免疫荧光染色检测胰岛素、C-肽的表达。用化学发光法测定胰岛素累积分泌量并用胰岛素释放实验检测分化的细胞对葡萄糖的反应性;并用Western blot的方法检测胰岛素的表达情况。 用STZ腹腔注射制作NOD/SCID鼠糖尿病模型,并将诱导后的细胞移植到糖尿病鼠左肾包膜下,动态观察血糖变化及糖尿病症状变化情况,测定移植前后小鼠胰岛素、C-肽水平,并行腹腔糖耐量试验检测移植细胞对血糖变化的反应情况。 对血糖降至正常的小鼠,摘除其左肾以观察血糖是否反弹,对摘除的小鼠的肾脏进行免疫组化检测,以及用RT-PCR的方法检测胰岛素表达相关基因的情况。 结果: 从人胎儿肝脏中分离、纯化得到梭形贴壁的MSCs;P3代hFLMSCs均有90%以上处于GO/GI期,表达CD90、CD105和CD166,不表达CD14、CD34、CD45以及AFP、HLA-DR等;在多次传代(P10代)及冻存半年后复苏仍保持正常核型。在常规诱导条件下,hFLMSCs可分化为成脂细胞、成骨细胞等。 用TAT-PDX1蛋白为主的方案体外诱导后,细胞快速变成圆形或椭圆形,并聚集形成越来越多的胰岛样细胞团;RT-PCR结果显示胰岛样细胞团表达胰岛相关基因,如Neuro D、Nkx2.2、Nkx6.1、Pax4、Pax6、Isl-1和PDX1等;经双硫腙染色后呈现棕红色阳性反应;激光共聚焦显微镜检测细胞团中胰岛素、C-肽等胰岛特异性蛋白表达阳性;化学发光法测得培养液上清中胰岛素累积分泌量逐渐增加,而且随着时间延长分泌量维持在较高水平;胰岛素释放实验表明胰岛样细胞团具有一定的糖反应性;Western blot证实诱导分化的胰岛样细胞团蛋白提取物中有胰岛素的表达。 用STZ腹腔注射制作NOD/SCID鼠糖尿病模型成模率高,移植胰岛样细胞团到糖尿病小鼠的肾包膜下,可观察到小鼠的血糖逐渐下降,而非移植组糖尿病小鼠则持续高血糖;移植前后小鼠的胰岛素、C-肽水平有显著性差异,腹腔糖耐量试验检测到移植细胞对血糖变化有反应。 摘除血糖降至正常的小鼠左肾,可见血糖出现反弹,再次升高;该鼠肾被膜下移植物的免疫组织化学染色可以看到胰岛素阳性细胞。取小鼠左肾,用RT-PCR的方法检测到人胰岛素相关基因(Nkx2.2、Nkx6.1、Pax6、Isl-1 and PDX1)的表达。 结论: 人12-20周流产胎儿肝脏含有MSCs,能在体外培养和扩增,hFLMSCs强表达CD90、CD105和CD166,不表达CD14、CD34、CD45以及AFP、HLA-DR等;hFLMSCs具有很强的多向分化能力,且免疫原性弱,能长时间保持正常核型,可以作为人类组织工程和再生医学研究的种子细胞。用TAT-PDX1蛋白为主的方案体外诱导hFLMSCs能分化为胰岛β样细胞并稳定表达胰岛素;移植到糖尿病鼠肾包膜下,能快速降低血糖水平;取出移植物,血糖水平再次升高。


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