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rhBMP-2对乳腺癌增殖、迁移及凋亡的影响

汪炬  
【摘要】: 骨形成蛋白-2(Bone Morphogenetic Protein-2, BMP-2)是一种具有独立诱导新骨形成的细胞因子,是TGF-p超家族的成员之一。各种原因造成的骨折与骨缺损在临床上十分常见,骨形态发生蛋白(BMPs)是治疗骨损伤的一种重要细胞因子。国外已有多种重组BMP药物(如BMP-2、BMP-7)上市,国内正处于起步阶段。 通过具有自主知识产权的独特工艺,使用大肠杆菌原核表达系统高效表达rhBMP-2,包涵体复性和纯化得到高纯度的rhBMP-2,整套工艺得率高,活性好,成本较低,非常适合产业化生产(参见附录三所列专利)。 通过氧化还原电泳、质谱、HPLC等手段检测我们制备的rhBMP-2分子量符合理论值,纯度≥95%,细胞学实验表明rhBMP-2可诱导成肌C2C12细胞向成骨细胞分化,并大量表达成骨细胞早期分化标志碱性磷酸酶,骨基质沉积,在分化末期形成大量的矿化小节;在体动物试验表明rhBMP-2可使小鼠后肢肌袋形成大量的异位骨,骨诱导活性良好。在新西兰兔桡骨置换试验中,与冠昊生物技术公司的骨填充材料复合5个月后,该复合材料与自体骨融合,并形成大量新生骨,同时大量的植入材料降解,与自体骨骨髓腔打通;而只植入该公司材料的对照组无论在新生骨的形成、材料的降解及与自体骨的融合方面均远远比rhBMP-2复合材料要差。 以上结果表明rhBMP-2的生产工艺成熟,基本达到国家药监局的要求,药效学研究表明该细胞因子诱导骨形成活性良好,具有广阔的临床应用前景。同时我们也要知道细胞因子是一类在胚胎发育以及维持细胞正常生理状态时发挥重要作用的活性肽,他们广泛参与细胞最基本的生命活动,如细胞的增殖、分化、凋亡以及衰老等,因此有必要进一步较深入和全面的探讨其在这些重要的细胞生理活动中的作用,在临床上更受到关注的则是细胞因子与肿瘤之间的关系。 乳腺癌是临床上的常见肿瘤,因此我们以乳腺癌细胞株MCF-7细胞(ERa-66阳性,不转移)以及MDA-MB-231细胞(ERα-66阴性,高转移)为研究对象,揭示rhBMP-2在其发生发展中的作用。 首先MCF-7和MDA-MB-231细胞均在mRNA水平表达BMPR1a、BMPR1b、BMPR2、Smad4, WB结果显示BMP-2可导致Smad1/5/8的磷酸化,表明两株细胞均具有完整的BMP信号通路。 BMP-2对乳腺癌细胞的增殖具有明显的抑制作用,MTT结果显示在MCF-7和MDA-MB-231细胞,20ng/ml的BMP-2的抑制率达到最高,分别为60%和30%。在MCF-7细胞,E2β可减弱BMP-2对肿瘤细胞增殖的抑制作用,抑制率从约45%下降到约25%,E2β的拮抗剂tamoxifen不能逆转E2β的作用。231细胞对雌激素E2β和tamoxifen不敏感。 流式细胞仪检测细胞周期结果表明,BMP-2使MCF-7和MDA-MB-231细胞G1期细胞比例增加,分别由63.7%增至70.8%,由46.7%增长至62%。Real-time PCR检测发现BMP-2可显著诱导P21的表达,由于P21是细胞周期蛋白抑制子,阻止细胞由G1期进入S期,因此我们认为BMP-2对细胞增殖的抑制主要是通过上调P21的表达而使肿瘤细胞发生G1期arrest。 BMP-2促进肿瘤细胞发生凋亡。根据流式细胞仪分析结果,在MCF-7细胞中,早期凋亡细胞由control组的1.0%上升到7.3%,而在MDA-MB-231细胞中,早期凋亡细胞由10.32%上升到34.26%,real-time PCR结果表明BMP-2可诱导细胞凋亡的执行者之一的Caspase-3的表达,提示BMP-2可通过上调Caspase-3的表达起到促进细胞凋亡的作用。 以上结果表明BMP-2对肿瘤细胞的增殖具有较强的抑制作用,它可通过上调P21、Caspase-3等,分别抑制肿瘤细胞的增殖,促进肿瘤细胞的凋亡。 在体水平的动物试验进一步证实了细胞学的观察。将MDA-MB-231细胞接种于裸鼠乳垫,并同时每天腹腔注射20ggBMP-2,16天后解剖结果显示,对照组共7只裸鼠,6只成瘤,1只不成瘤;BMP-2处理组7只裸鼠,]只成瘤,6只不成瘤,表明BMP-2在乳腺癌早期具有显著的抑制作用。 建立Balb/c(nu/nu)裸鼠人源性乳腺癌MCF-7细胞移植瘤模型,每天腹腔注射20μg BMP-2,给药16天后处死裸鼠,取出肿瘤,BMP-2组与对照组肿瘤大小无明显差异,亦没有发现转移病灶。 本研究也探讨了BMP-2在肿瘤的转移方面的作用,由于MDA-MB-231细胞是高转移的肿瘤细胞,因此研究以MCF-7细胞为主。 1-50ng/mlBMP-2均可使MCF-7细胞发生形态上的变化,由原来的上皮细胞形态转变为间质细胞的形态,如从多角形,细胞呈嵌铺砖状,转变为细胞间的紧密接触变得松散,细胞向梭形转化。原子力显微镜观察显示MCF-7细胞变得狭长,扁平,出现伪足,表明细胞的迁移性增强。 划痕愈合试验和transwell细胞侵袭力试验显示30ng/ml的BMP-2处理1天后细胞迁移性最强,real-time PCR结果表明BMP-2上调与迁移力正相关的一系列基因的表达,如ID1、Pail;WB结果显示BMP-2显著上调CD44的表达,这些结果表明BMP-2促进细胞的迁移性是由促进一系列与迁移相关的基因的表达导致的。 由于MCF-7和MDA-MB-231细胞均未能在肺部形成转移肿瘤结节,因此我们用小鼠4T1乳腺癌细胞的肺转移模型在体水平探讨BMP-2对乳腺癌转移的促进作用。结果显示BMP-2处理组肺部乳腺癌结节明显多于对照组,免疫组化检测表明处理组肺部切片pi-Smadl/5/8、α-SMA、Vimentin等表达水平均显著高于对照组,表明BMP-2通过激活BMP信号途径,诱导细胞表达间质细胞的MARKER蛋白,发生EMT转化,侵袭性增强。E-Cadherin的表达也较对照组略高,表明肺部肿瘤的细胞来源为乳腺上皮细胞。 由于雌激素信号途径在乳腺癌的发生发展中占据中心地位,我们也同时探讨了BMP-2信号与雌激素途径的Crosstalk,并由此发现在mRNA水平BMP-2对ERα-36的诱导表达。通过分析该分子C端的特异性片段,设计并合成了IV10的短肽,将其与KLH偶联,并免疫兔子获得抗血清,纯化后即得到自制的ERa-36的特异性抗体,WB结果表明BMP-2可在蛋白水平以剂量依赖的方式诱导其表达,并可为BMP-2的竞争性抑制剂noggin所抑制。由于ERa-36参与乳腺癌内分泌治疗的抗性,这一结果提示BMP-2可能与内分泌治疗抗性有关。 综合以上结果,我们可把BMP-2对乳腺癌的影响分为两类,其一为对乳腺癌的负性调控,包括对肿瘤细胞周期的G1 arrest以及对肿瘤细胞凋亡的促进;其二为对乳腺癌的正性调控,包括对肿瘤迁移性的促进,可能包括BMP-2对ERa-36表达的上调增加其对内分泌治疗的抗性。然而,这两类作用可能最终相互抵消,致使我们在裸鼠移植瘤的模型上看不到BMP-2对肿瘤的实际影响。 由此,我们得到以下结论,我们生产的rhBMP-2具有较强的诱导骨修复能力,BMP-2与肿瘤的关系密切,但由于同时具有正调控和负调控作用,实际上对肿瘤的综合作用是比较复杂的。


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