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复方丹参对滋养细胞氧化应激保护作用机制的研究

侯延庆  
【摘要】: 第一章:复方丹参对氧化应激的滋养细胞的影响 目的:确定复方丹参对氧化应激的滋养细胞的有效保护作用浓度范围,并选出最佳保护浓度。 方法:用不同浓度的复方丹参(0 mg/mL、1.25mg/mL、2.50mg/mL、6.25mg/mL和12.5mg/mL)对滋养细胞JEG-3和JAR进行预培养24h,再用5mmol/L的H202刺激3h建立氧化应激模型,用噻唑蓝(MTT)法测细胞的存活数,用倒置相差显微镜和透射电镜观察细胞形态结构的变化。 结果:复方丹参(1.25mg/mL、2.50mg/mL、6.25mg/mL)预处理的滋养细胞,H202氧化损伤后,与对照组(0 mg/mL)比较,随丹参浓度增加,MTT光密度(OD)值呈上升趋势,即细胞存活数增加;与其它组比较,高浓度复方丹参(12.50mg/mL)组OD值最低,即细胞存活数最低,各浓度组间差异有统计学意义(P0.01);两种滋养细胞同一浓度组内的细胞存活数无明显差异(P0.05)。显微镜下观察,未加复方丹参的滋养细胞在H202损伤后,细胞成片脱落、坏死,存活的细胞明显减少,细胞间隙变宽;6.25mg/mL复方丹参组细胞损伤程度明显减轻,而12.5mg/mL复方丹参组细胞与其它组比较,损伤最重。透射电镜观察结果:H202组细胞有不同程度的围绕核膜的染色质浓缩,胞质空泡样改变明显、细胞皱缩,严重者核膜消失,有凋亡小体形成。丹参组细胞损伤明显减轻,形态接近正常细胞。 结论:复方丹参对滋养细胞的氧化损伤具有保护作用,有效保护作用浓度为:1.25mg/mL、2.50mg/mL和6.25mg/mL,最佳保护浓度为6.25mg/mL。但高浓度复方丹参可加重细胞损伤。 第二章:复方丹参对氧化应激的滋养细胞保护作用机制的研究 目的:探讨复方丹参对氧化应激的滋养细胞JEG-3和JAR细胞的抗氧化保护作用机制 方法:用不同浓度的复方丹参(0 mg/mL、1.25mg/mL、2.50mg/mL、6.25mg/mL)对滋养细胞JEG-3和JAR进行预培养24h,再用5mmol/L的H2O2刺激3h建立氧化应激模型,细胞内氧化应激水平、细胞裂解液中丙二醛(MDA)的含量、细胞培养上清中组织多肽抗原(TPA)的含量分别用活性氧(ROS)探针(DCFH-DA)法、化学比色和ELISA法测定;细胞内超氧化物歧化酶(SOD)的活性、mRNA及蛋白的表达分别用化学比色、实时荧光定量RT-PCR,及Western Blot检测,膜修复蛋白dysferlin的表达则用荧光免疫细胞化学法检测。 结果:与对照组比较,复方丹参组ROS、MDA、TPA及dysferlin的水平明显减少,且随着复方丹参浓度的增加呈下降趋势;SOD活性、SOD-mRNA和蛋白表达水平,明显升高,且随复方丹参浓度的增加而递增;上述指标在同一细胞内各浓度组间差异有统计学意义(P0.05),而在同一浓度组内的JEG-3和JAR细胞之间则无明显差异(P0.05)。 结论:(1)复方丹参对氧化应激的滋养细胞有抗氧化保护作用。其保护作用机制可能为:①增强SOD活性,上调SOD-mRNA转录及翻译水平。②减少ROS生成或增加ROS清除。③减少MDA的生成。④减少TPA的产生。(2)氧化应激模型滋养细胞JEG-3和JAR表达dysferlin随着氧化损伤加重而增加,可能为代偿反应。 第三章:复方丹参对滋养细胞NF-κB、ICAM-1及sFlt-1表达的影响 目的:探讨复方丹参对氧化损伤的滋养细胞NF-κB、ICAM-1及sFlt-1表达的影响 方法:用不同浓度的复方丹参(0 mg/mL、1.25mg/mL、2.50mg/mL和6.25mg/mL)对滋养细胞JEG-3和JAR进行预培养24h,再用5mmol/L的H202刺激3h诱导氧化应激。用荧光免疫细胞化学法检测细胞中核因子NF-κBp65及细胞间粘附分子1(ICAM-1)的表达,而可溶性的血管内皮生长因子受体1(sFlt-1)及其配体血管内皮生长因子(VEGF-A)则分别用实时荧光定量RT-PCR、ELISA及Western blot检测。 结果:复方丹参预处理的滋养细胞,H2O2氧化损伤后,与对照组比较,NF-κBp65、ICAM-1、sFlt-1及VEGF-A的表达水平均明显减少,且随着复方丹参浓度的增加而呈下降趋势;同一细胞内各浓度组间上述指标差异有统计学意义(P0.05);同一浓度组内JEG-3和JAR细胞之间比较,则无明显差异(P0.05)。 结论:复方丹参具有抗炎作用。可能与抑制氧化应激的滋养细胞表达炎症相关因子NF-κB、ICAM-1和血管损伤因子sFlt-1/VEGF-A等有关。 第四章:复方丹参对子痫前期血清诱导滋养细胞凋亡的影响 目的:探讨复方丹参对子痫前期(PE)患者血清诱导滋养细胞凋亡的影响。 方法:用0.25%胰酶和300u/mL的DNaseⅠ和Percoll密度梯度分离液提取纯化人足月正常妊娠胎盘滋养细胞(PT),用荧光免疫细胞化学法、激光共聚焦检测细胞爬片中角蛋白(CK7,滋养细胞)及波形蛋白(Vimentin,间质来源细胞)的表达进行滋养细胞的鉴定;用6.25 mg/mL复方丹参对PE血清刺激的三种滋养细胞JEG-3、JAAR和PT进行干预。实验分组:正常对照NC组(10%的胎牛血清)、对照NP组(10%正常孕妇血清)、PE组(轻度mPE和重度sPE,10%PE血清)及sPE+DS组(加复方丹参6.25mg/mL预培养24h,再加10%sPE血清)。孕妇血清培养组均先用含0.1%牛血清白蛋白(BSA)的无血清培养液培养细胞24h,再加孕妇血清继续培养24h收集细胞,NC组正常条件培养48h,分别用流式细胞仪Annexin V/PI双染和TUNEL(荧光)法检测凋亡情况。 结果:流式细胞仪检测所见,NC组细胞凋亡率均明显低于其它各组(P0.05)。各种滋养细胞均表现为sPE组细胞凋亡率明显高于NC、NP、mPE组及sPE+DS组(P0.01);同一种细胞内NP组、mPE组和sPE+DS组间差异无统计学意义(P0.05);JEG-3和JAR细胞之间对应各组间的差异无统计学意义(P0.05);PT各组细胞的凋亡率均明显高于JEG-3和JAR细胞中对应组(P0.05)。TUNEL凋亡检测结果显示:各种滋养细胞sPE组细胞凋亡阳性细胞数明显高于NC组和sPE+DS组,而NC组凋亡阳性细胞数最少,各组间差异有统计学意义(P0.05);JEG-3和JAR细胞对应组间无明显差异(P0.05);PT各组细胞凋亡率均明显高于JEG-3和JAR细胞对应组(P0.05)。 结论:重度子痫前期患者血清可明显促进对滋养细胞的凋亡。复方丹参对子痫前期血清诱导的滋养细胞凋亡有抑制作用,可能与其抗氧化作用有关。


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