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重组酿酒酵母利用纤维素发酵乙醇的代谢工程研究

全艳彩  
【摘要】: 纤维素是自然界中存在的最丰富、最廉价的可再生资源。纤维素可被降解并通过发酵转变成乙醇、燃料和其他化学产品。纤维素乙醇因被当作最佳液体替代燃料成为工业生物技术的研究热点。本研究在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中同时表达三类绿色木霉(Trichoderma viride) AS3.3711纤维素酶基因,构建了具有纤维素分解能力的酿酒酵母菌株,并以天然纤维素甘蔗渣为底物进行发酵条件的摸索。 设计突变引物,将本实验室保存的绿色木霉β-葡萄糖苷酶Ⅰ(BGLⅠ)的编码基因bgll上的NheⅠ酶切位点进行同义突变消除。然后将突变后的bgl1基因插入多拷贝整合型表达载体pScIKP,构建得到表达载体pScIKP-bgll。用限制性内切酶NheⅠ酶切本实验室保存的pScIKP-ec质粒,同时用同尾酶NheⅠ和XbaⅠ酶切pScIKP-bgll质粒,将两者用T4连接酶连接并转化大肠杆菌JM109,菌落PCR及质粒酶切鉴定,证明各基因是头尾相连正向连接的三基因表达载体pScIKP-ecb。将表达载体pScIKP-ecb电转入工业酿酒酵母AS2.489中,并利用高浓度G418筛选高抗转化子,获得目的菌株ecb3000。 本研究以滤纸酶活性(FPA)来检测纤维素酶系的综合活力;以羧甲基纤维素(CMC)为底物,DNS法测定ecb3000的内切葡聚糖酶Ⅲ(EGⅢ)及外切葡聚糖酶Ⅱ(CBHⅡ)的酶活力;以对硝基苯基-β-D-纤维二糖苷(pNPC)为底物专一性检测重组酿酒酵母中CBHⅡ的酶活力;而BGLⅠ的酶活力则通过其专一性底物对-硝基苯酚-β-D-葡萄糖(pNPG)进行检测。结果表明:三个纤维素酶基因在重组酿酒酵母菌株中能够同时表达,并且分泌到胞外。其中,该重组酿酒酵母产酶高峰出现在84 h后,其中FPA最高酶活为0.583 u/mL,CMC的最高酶活为3.70 u/mLCBHⅡ最高酶活为0.02 u/mL,BGLⅠ最高酶活为0.58 u/mL。 本研究建立了重组酿酒酵母的生长培养条件,从葡萄糖含量、玉米浆添加量、转速、尿素添加量四个因素考虑,通过正交实验确定了该重组酵母的最佳生长培养条件为:转速250 rpm,100g/L葡萄糖,12g/L CSL,1g/L尿素;各因素的影响程度为葡萄糖玉米浆转速尿素。在其余条件不变的条件下,调整氮源配方与比例,获得最佳生长培养基方案:葡萄糖100g/L,玉米浆12 g/L和硫酸铵7g/L,30℃、250 rpm培养。 将甘蔗渣进行烘干粉碎,过35目分析筛。以甘蔗渣为唯一碳源,用正交法优化发酵培养基,摸索重组酿酒酵母ecb3000的摇瓶发酵条件,确定最佳条件为接种量20%,玉米浆28g/L,硫酸铵7g/L。在此基础上,摸索重组酿酒酵母5L发酵罐的发酵工艺条件,确定前酵期的条件同种子液的培养条件一样:30℃,250 rpm,pH5.0,通气培养;主酵期和后酵期的条件为:32℃,pH 4.5,不搅拌,厌氧培养。结果显示发酵液中乙醇的最高浓度可以达到4.6%(v/v),达到为理论值的77.46%。


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