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脐带间充质干细胞培养及体外重建角膜后板层的初步研究

陈义  
【摘要】: 目的(1)应用改良及传统培养方法体外培养兔角膜基质细胞和人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUCMSCs),观察其生物学特性,为下一步角膜后板层重建奠定基础。(2)探讨以板层猪角膜基质后弹力层面为载体培养人脐带间充质干细胞初步构建组织工程角膜后板层的可行性,为组织工程角膜后板层的构建提供新的种子细胞来源和适宜的载体材料。 方法(1)采用新培养法—悬浮基质片法及传统方法对兔角膜基质细胞进行分离、培养及鉴定。(2)采用新培养法—脐带组织片悬浮法及传统方法对人脐带MSCs进行分离、纯化、扩增、传代,观察其体外生长特征。(3)采用流式细胞术对体外培养的人脐带MSCs进行免疫表型鉴定,并行成脂细胞和成骨细胞诱导分化,鉴定其干细胞特性。(4)将第五代脐带MSCs接种于去除内皮细胞的板层猪角膜基质后弹力层面上进行培养。(5)待细胞融合形成单层后,观察接种后细胞的生长特性,3周后行HE染色及扫描电镜、透射电镜等对细胞进行形态学观察。免疫组化法检测接种后干细胞角膜内皮细胞抗原标志物神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达。 结果(1)新的培养方法—悬浮基质片法及脐带组织片悬浮法可成功培养出角膜基质细胞及脐带间充质干细胞,较传统方法便捷、可靠。体外培养的角膜基质细胞及脐带MSCs均呈成纤维细胞形态,增殖活力好。(2)流式细胞仪示:培养的人脐带MSCs表达间充质干细胞的特异标记包括CD13、CD29、CD44、CD105,但不表达造血和内皮细胞的标志CD31、CD34、CD45。经体外诱导证实,人脐带MSCs具有向脂肪细胞及成骨细胞方向分化的能力。(3)将传代后的人脐带MSCs接种于板层猪角膜基质后弹力层面上进行培养,细胞可在后弹力层面贴附,单层生长良好;电镜下见细胞表面微绒毛丰富,细胞之间紧密连接,富含细胞器。经培养3周后部分干细胞表达角膜内皮细胞抗原标志物神经元特异性烯醇化酶(NSE)。 结论(1)本研究探讨了兔角膜基质细胞和人脐带MSCs体外分离、培养的改良方法,体外培养的角膜基质细胞和脐带MSCs均呈成纤维细胞形态,具有较强增殖能力。(2)体外培养的人脐带间充质干细胞,具有多向分化潜能。以板层猪角膜基质后弹力层面为载体可成功培养人脐带间充质干细胞,构建出与正常角膜后板层相似的组织,有望为组织工程角膜后板层重建提供一种新的种子细胞来源和适宜的载体材料,并为进一步深入进行功能性研究和移植提供了实验基础。


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