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脐带间充质干细胞修复化疗所致卵巢颗粒细胞损伤的体外实验

陈芳  
【摘要】: 研究目的: 1.建立人脐带间充质干细胞(UC-MSCs)体外分离、培养的方法,研究其生物学特性和表型特征,用于本实验下一步研究及进一步用于组织工程、细胞和分子生物学的研究。 2.探讨人UC-MSCs对化疗药物盐酸氮芥诱导的卵巢颗粒细胞(GCs)凋亡的影响及可能机制。研究方法: 1.在无菌条件下取足月健康胎儿脐带标本,用双酶消化法、组织块贴壁法两种方法分离、纯化脐带间充质干细胞(UC-MSCs),同时进行两种方法的对比。分离的原代干细胞用含10%的胎牛血清的DMEM/F12培养基培养,消化传代后,取P4-P8代的细胞做共培养修复用。 2.采自中山大学附属第一医院生殖中心接受体外受精-胚胎移植(IVF-ET)的患者共60余例,年龄27-35岁,有排卵证据,基础状态生殖激素水平正常,均为输卵管因素或男方因素不孕者。采用促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-a)/基因重组人卵泡刺激素(rFSH)/人绝经期促性腺激素(HMG)/人绒毛膜促性腺激素(HCG)超促排卵方案,定期监测卵泡发育。当优势卵泡直径17mm时,肌内注射10,000UHCG,于注射36 h后B超下经阴道穿刺卵泡采集卵母细胞,同时收集卵泡液。分离出其内的卵巢颗粒细胞,待其贴壁加入不同浓度的化疗药物盐酸氮芥(浓度分别为0.5mg/l、2.5mg/l、5mg/l)致培养基中作用24h后,检测凋亡后选择最适浓度,一组为待其损伤后与脐带间充质干细胞以不同比例共培养48h,另一组为与脐带间充质干细胞共培养6h后加入化疗药物致损伤,化疗药物同样作用24h,脐带间充质干细胞共培养72h,采用Hoechst33342-PI双染,检测凋亡率,DNA-ladder检测凋亡片段产生,Western-blot检测颗粒细胞凋亡相关蛋白bcl-2和caspase-3表达的变化。评价UC-MSCs在化疗所致卵巢颗粒细胞损伤中的修复作用。 结果: 1.体外培养的UC-MSCs形态均一,呈长梭行旋窝状生长,培养的第三代细胞97%以上表达CD44,CD29,CD59,CD 105,但不表达造血及内皮细胞相关抗原CD28,CD31,CD34,CD45,亦不表达免疫排斥相关抗原CD40, CD86, HLA-DR,证实为间充质干细胞。 2. UC-MSCs大部分处于静止期和DNA合成前(G0/G1期),只有少数处于分裂期和DNA合成期。 3.盐酸氮芥浓度为5mg/l时,卵巢颗粒细胞的凋亡率增高,生长抑制程度明显,在DNA-ladder上也可见明显的断裂条带,选用该浓度来诱导颗粒细胞凋亡。 4.与UC-MSCs体外共培养修复化疗后所致颗粒细胞损伤的效果不是十分理想,但在预防化疗所致颗粒细胞损伤的效果较对照组差异有统计学意义,即在与脐带间充质干细胞共培养6h后加入凋亡诱导剂,其凋亡率较实验对照组明显降低(共培养组早期凋亡率为22.43±0.45%,晚期凋亡率为13.57±1.58%,实验对照组早期凋亡率为25.23±1.07%,晚期凋亡率为29.57±2.74%)。差异有统计学意义(P值均为0.000)。 5. Western-blot结果显示,共培养组颗粒细胞bcl-2表达水平较阴性对照组增高,而caspase-3表达则下调。结论: 人UC-MSCs可以有效预防化疗所致卵巢颗粒细胞损伤,且能够上调bcl-2的表达和下调caspase-3的表达从而抑制颗粒细胞的凋亡。


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