蝴蝶兰栽培品种叶片培养及八倍体诱导的研究

【摘要】：蝴蝶兰是一种重要的经济花卉植物。近年来通过品种选育和工厂化生产技术的研发推广,蝴蝶兰新品种不断产生,生产规模和市场占有率也不断增大。但生产周期长,组培扩繁效率低和可供利用的资源品种较少始终是困扰着蝴蝶兰产业长足发展的障碍。因此迫切需要在组培扩繁方法和种质创新方面进行研究。本研究通过试验9种蝴蝶兰基因型材料,探讨组培相关的影响因子,包括无菌试管苗的取材部位、不同的基础培养基、不同细胞分裂素及其与生长素的配合、暗培养时间、外植体幼嫩程度、有机添加物以及基因型差异等对诱导不定芽和植株再生的影响。也探索了秋水仙素诱变蝴蝶兰叶片多倍体不定芽的两种方法,摸索出诱导八倍体试管苗较适宜的秋水仙素处理浓度和处理时间,为蝴蝶兰新品种选育和规模化生产提供有用参考。主要实验结果如下: 1选取6个蝴蝶兰品种(品系),在NDM和1/2MS两种培养基中诱导叶片分化不定芽。结果表明,不同品种在同一培养基中不定芽分化率差异极大,在1/2MS中,0377-2诱导率为25.0%,‘满天红’、‘夕阳红’、‘荷黄’等为0。同一品种在不同培养基中芽诱导率也有很大差异,如0377-2在1/2MS培养基中不定芽诱导率为25.0%,而在NDM培养基中诱导率为0。总体上1/2MS培养基诱导不定芽效果好于NDM培养基。 2分别对自育品系0377-2的幼嫩叶片和试管苗根尖(段)进行培养,在1/2MS+3mg/L TDZ培养基中,叶片不定芽分化率为34.9%,而根段分化原球茎的诱导率仅为13.3%;且叶片外植体分化不定芽时间短,只需2个月,根段诱导分化原球茎需要3-4个月。说明相对而言,根段诱导再分化较叶片诱导再分化要难。在1/2MS+3mg/L TDZ培养基中添加200ml椰汁可能有利于促进根段诱导愈伤组织。 3培养基分别添加细胞分裂素TDZ、6-BA、KT-30、Ad和生长素NAA、IBA及其组合试验的结果表明,细胞分裂素诱导叶片分化不定芽,以TDZ效果最好,其次为6-BA,再次是KT-30和Ad。TDZ、6-BA单独使用效果好于与NAA组合使用。单一添加TDZ、6-BA、NAA时,不定芽诱导率分别为100%、70.3%、31.7%;而在TDZ与NAA、6-BA与NAA组合试验中,芽诱导率分别为96.7%、33.3%。当TDZ浓度为3mg/L时,品种‘红天使’不定芽诱导率达到100%,平均不定芽数达18.2个。但TDZ对不定芽伸长生长和试管苗生根表现为抑制作用。生长素IBA能够促进试管苗出根,适宜用量为1mg/L—3mg/L。 4研究结果还表明,对于叶片培养诱导不定芽,小于15d的暗培养时间为宜;叶长小于1cm的叶片外植体诱导效果最好。 5应用秋水仙素浸泡和共培养两种方法进行离体叶片诱导多倍体。秋水仙素浸泡法是将外植体叶片在1/2MS+ 1mg/L TDZ培养基上诱导分化1个月后,再用不同浓度秋水仙素溶液浸泡处理带芽叶片,诱导多倍体产生。秋水仙素共培养法是将外植体叶片在含不同浓度秋水仙素的1/2MS+ 1mg/L TDZ芽分化培养基上共培养一定时间后,再转接入不含秋水仙素的相同芽分化培养基中诱导不定芽,继而获得加倍的再生植株。实验结果表明:用共培养法在含0.01%的秋水仙素中共培养30d,八倍体诱导率达33.3%,八倍体苗为7株;浸泡法中以0.1%秋水仙素处理5d的诱变率最高,八倍体诱导率为6.32%,八倍体苗为11株。两种方法各有优缺点:共培养法优点在于八倍体诱导率高,缺点是对外植体叶片毒害大,最终成苗数少;浸泡法优点在于对外植体带芽叶片毒害小,最后成苗数高,而八倍体诱导率低。 四倍体品种‘红天使’经秋水仙素诱变处理,获得八倍体植株。经检测,再生变异株根尖染色体数2n=8x=152,并表现出生长缓慢,叶片增厚,根粗短,气孔增大,气孔密度减小等性状。