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华南地区鸭源性H9亚型流感病毒的基因特性研究

徐克敏  
【摘要】: 背景和目的: 1997,1999香港发生的禽流感H5N1,H9N2直接感染人的报道提醒我们:人类大流感的流行已为之不远了。研究表明,H9在欧亚大陆的禽类中有三个系列流行,分别以Qa/HK/G1/97,Dk/HK/Y280/97,Dk/HK/Y439/97为代表。感染人的H9N2属于Qa/HK/G1/97样病毒,而感染猪的病毒属于Dk/HK/Y280/97,且它与A/Sidney/3/97同时在猪中流行。最近Matrosovich等人发现华南地区的禽H9N2有着与人流感病毒受体结合的特性,因此,H9最有可能成为下次大流感流行的亚型。然而以前的研究主要是集中在这一地区的陆地禽类,而对水鸟类等流感病毒自然基因库的研究未见报道。本文旨在通过系统全面的调查,探讨在陆地禽类中流行的H9与在水鸟类流行的H9之间的关系,并有可能在水鸟中发现目前已在陆地禽类中广泛流行的Qa/HK/G1/97,Dk/HK/Y280/97的前体病毒。 材料和方法: 每星期收集一次标本,收集的标本常规处理,9-11日龄鸡胚尿囊腔接种,35℃培养72小时,收取尿囊液,血凝阳性(AD≥16)且细菌培养阴性者-70℃保存并进一步做HI,NI实验鉴定亚型。从中选取12株H9N2,2株H9N1病毒代表株进行下一步的分子生物学工作。用Qiagen的RNeasy RNA提取试剂盒按说明提取,提取的RNA逆转录合成cDNA,cDNA为PGR反应扩增的模板,特异性的引物是针对各个基因片段设计的。PCR产物用PGR纯化试剂盒纯化之后,进行测序反应。最后标本在DNA测序仪(377)电泳和分析。所有基因序列均在GCG10.2版本上编辑和处理。进化树的分析是在PAUP4.1 助兴大学医学烷雨士学泣柱卫 版本上进行。序列比较和同源性分析是在GeneDoc 2.3上完成。 结果: 1.流行病学:在各种禽类中常年都分离到流感病毒。在鸭中分离到大部分的流感病 毒亚型,而在鸡及鹤粪等陆地禽类中则主要为Hg,H6亚型流感病毒。值得注意的 是我们首次在鹤鹌中发现了HSNI流感病毒。 2.Hg亚型的分析: (1)抗原性分析表明七株HgNZ病毒与w/HK/YZSO/97和n/HK/Gg/97病毒反应相 似。而其它病毒株与抗血清不反应或反应的滴度很低。因此,在鸭中至少流 行着两种不同的Hg亚型病毒。 (2)Hg的m进化树表明HgNZ病毒属于Ck/Bet/l/94或Dk/HK/Y280/97样病毒系列, 但是它们处于进化的不同阶段,有些病毒与早期的Ck/Bet/1/94相似,而有的 病毒与1997年及最近从陆地禽类中分离的Hg病毒最相近。此提示在陆地禽类 中流行的Hg病毒在不同时期间断多次地反传至鸭之后,又有保持进化静止的 趋势。NZ的进化树与m相似。而HgNI的HA与趾/HK/Y439/97相似,NI与 GS/Gd/l/96样病毒有着相同的进化模式但又保持着明显的组外关系。值得注 意的是这些鸭HgNZ病毒也具有人病毒受体结合的特性,在-4位点与从这一地 区陆地禽类中分离到的病毒相同,为精氨酸(R)。 内部基因的进化树表明这些回传至鸭的病毒RNP复合物大部分都被置换为 鸭病毒的基因片段。而大部分病毒的 NS和 M基因都与 Ck/Bet/l/94或 Qa/HK/GI/97样病毒最相近。两株HgNI病毒的NS基因片段与其*基因的进化通 路相似,与Gs/Gd/l/96样病毒最为相近。 结论:” 1.流感病毒常年在华南地区的各种禽类中流行; 2.在华南地区自然基因库中(鸭)流行的Hg有两个系列分别与Ck/Bet/1/94(或 Dk/HK/Y280/97),Dk/HK/Y439/97相似,而未见有与HSNI/97内部基因高度同源 的Qa/HK/GI/97样病毒在其中流行; 2 血兴大学医学烷雨士学应移文 3.在鸭中流行的Ck/Bet/l/94或Dk/HK/Y280/97样病毒是由在陆地禽类中流行的Hg 在不同时期反复多次间断地反传至鸭而来的。由于不断的反传,导致流感病毒的 进化速度加快,在自然基因库鸭中不能保持进化的相对静止状态: J 4.HSNI用7的m供体病毒k北d八乃6(HSNI)病毒可能也来自于华南地区的水禽类 自然基因库; 5.流感病毒大流行株可以不经过任何中间宿主,直接在其自然基因库鸭中产生。


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