甲醛对大鼠主动脉内皮细胞的毒性作用

【摘要】：近年来，有研究提出内源性甲醛(FA)可能是启动内皮细胞损伤，导致动脉粥样硬化的一个潜在危险因素。内源性甲醛是人体内甲胺(MA)氧化脱氨的代谢产物，研究表明甲胺本身对血管内皮相对无毒，但在SSAO催化下，其脱氨产物可引起人脐静脉内皮细胞及内皮细胞株CPA47损伤，但有关血浆中内源性甲醛浓度及其对血管内皮细胞毒性作用的量效关系数据仍未见报道。本研究通过改良KC1-SDS沉淀法测定蛋白质-DNA交联(DPC)、乳酸脱氢酶释放法检测膜完整性，利用倒置相差显微镜、激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)观察细胞形态、细胞骨架的完整性各指标，从细胞水平研究血液中内源性甲醛浓度与血管内皮细胞的损伤是否存在直接关系。 主要研究内容和方法： 一、大鼠主动脉“环”植块培养法分离培养大鼠主动脉内皮细胞，在取出大鼠胸主动脉时进行了血管外膜的瞬间热处理(60℃，2s)，并通过S-P免疫组化染色检测Ⅷ因子相关抗原对内皮细胞进行鉴定。 二、通过免疫组化染色比较了瞬间热处理与无热处理对早期植块培养过程中迁出内皮细胞纯度的影响。 三、取3～4代大鼠主动脉内皮细胞，用含不同浓度甲醛(0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2mM)的无血清培养基，孵育1.5h；及含0.05、0.1mM甲醛的无血清培养基加入后各孵育0、0.5、1、1.5、2、4h，收集细胞，用改良KC1-SDS沉淀法测定各组细胞蛋白质-DNA交联(DPC)。 四、不同浓度甲醛孵育1.5h；及用含0.05、0.1mM甲醛的无血清培养基孵育不同时间后收集培养基上清，乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒测定培养基中酶活性。 五、不同浓度甲醛孵育1.5h后倒置相差显微镜观察细胞形态改变。 六、不同浓度甲醛孵育1.5h后，FITC-鬼笔环肽标记F-actin，激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)观察细胞骨架结构改变。 研究结果： 一、大鼠主动脉内皮细胞呈多角形或梭形，呈鹅孵石镶嵌排列。免疫组化S-P法检查Ⅷ因子相关抗原，胞浆中有棕黄色着色，即呈阳性反应。 汕头大学医学院硕士学位论文 二、热处理组内皮细胞/总细胞数比率(又士s)为0.678士0.154，对照组为0.431 士0.194。与无热处理法比较，瞬间热处理使植块培养法的内皮细胞纯度显 著提高(P0 05)。 三、浓度为。、0.01、0.05、0.1、0.5、l、ZmM甲醛作用l.sh，交联率(又士s)分 别为1.43士0.63、2.1社1.44、3.27士1.26、6.23士3.22、8.12士2.49、9.57士1.87、 1334士1.82%。0.5一ZmM甲醛作用1.5h后引起DPC形成明显增高 (P0.05)。0.smM组比0.olmM组交联率升高(P0.05);lm五人组比0，01、 0.05m务江组交联率明显升高(P0.01)而O.smM与lmM组之间差别无统计 学意义:ZmM组交联率比各低剂量组高，且差别有统计学意义(P0.05)。 浓度为0.05mM的甲醛作用0、05、l、1.5、2、4h，交联率(又士s)分别为 1 .18士0，29、3.07士0.37、3.13士0.68、3.27士1.26、6.93士0.73、10.15士2，91%;浓 度为0.lmM的甲醛作用。、0.5、l、1.5、2、4h，交联率(又士s)分别为1.93士0.45、 3.9士1.45、4.2士1.04、6.23士3.22、10.8士0.90、18.6士4.5%。0.05InM甲醛作用 Zh后引起交联率比各短时间组明显升高(P0.01)，4h组与Zh组差别也有 统计学意义(P0.01)。0.lmM组作用Zh后引起交联率明显升高(P0.01)， 但与1.5h组无显著差异，4h组与各短时间组有显著差异(P0.01)。 四、浓度为0、0.01、005、0.2、05、l、ZmM甲醛作用l.sh，LoH释放(又士s) 分别为3.26士3.62、2.01士1.36、2.19土1.10、3.09士1.48、4.59士2.13、5.97士4.16、 11.48士2.26%。0.01一lmM组与对照比无明显差异(P0.05)，ZmM组LDH 释放明显升高，与0一0.smM各剂量组比较均有显著差异(P0.05)。0.05mM 和O.lmM组作用不同时间LDH释放量差异无显著性(P0.05)。 五、0.olmM、0.05mM组作用1.5h在光镜下观察内皮细胞形态无明显改变;) 0.lmM甲醛作用1.5h后，细胞收缩、变圆、肿胀，细胞间隙增宽，该变化 随着甲醛浓度增高而更明显。 六、对照组内皮细胞肌动蛋白微丝围绕在细胞四围呈条带状，排列整齐、分布均 匀、粗细胞匀称，0.olmM、0.O5mM组细胞骨架无明显改变，O.lmM组细 胞肌动蛋白微丝排列紊乱，随着甲醛浓度升高肌动蛋白微丝排列紊乱越明 显，ZmM组部分细胞微丝断裂，收缩呈絮状。 结论与意义: 汕头大学医学院硕士学位论文 一、建立并改良了大鼠主动脉内皮细胞分离培养法。 二、大鼠主动脉内皮细胞暴露于甲醛下可引起DPC的形成，并呈剂量依赖性和 时间依赖性趋势。提示，内源性甲醛浓度增高，或生理浓度的内源性甲醛长 期作用，可引起DPC，可能会导致一些重要基因表达异常，从而影响细胞 功能或引起内皮细胞凋亡，从而参与动脉粥样硬化(AS)的过程。 三、较高浓度甲醛( 0.lmM)可引起内皮细胞膜通透性增高，并呈剂量依赖性增 高。说明甲醛对内皮细胞具有细胞毒性。 四、甲醛作用后细胞主要表现为细胞收缩、变圆、细胞间隙增宽。细胞回缩是血 管壁通透性增高的主要机制，而内皮细胞通透性增高，有利于动脉粥样硬化 斑块的形