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共振光散射技术测定生物大分子

丁卫锋  
【摘要】:核酸和蛋白质的定量分析在生物化学和临床医学中很重要。常用的方法主要是分光光 度法和荧光法,但它们都存在严重的缺陷。分光光度法灵敏度低、步骤复杂、耗时长,荧 光光度法仅限于荧光体系且试剂昂贵有毒。共振光散射(RLS)技术灵敏度高、简便快捷、 选择性好,是一种新型生化分析方法。 小分子与核酸结合方式有三种:嵌入式、沟槽式和静电引力。这类研究有助于揭示癌 症的病变机理及研制抗癌新药,因而具有十分重要的意义。 本论文提出并建立了六种RLS新方法,探讨了小分子与核酸的作用机理,具体如下: 第一,四苯基钴卟啉RLS法测定核酸。在最佳实验条件下,核酸能增强四苯基钴卟啉 的弱RLS信号,并且增强的RLS强度与核酸浓度成正比。小牛胸腺DNA、鱼精DNA和 酵母RNA的线性范围分别为0.05-3.5μgml~-1、0.03-4.2μgml~-1、0.02-4.9μgml~-1,检测限分 别为3.5 ng ml~-1、4.5 ng ml~-1、6.1 ng m1~-1。合成试样测定结果满意。 第二,四苯基铁卟啉RLS法测定核酸。四苯基铁卟啉与核酸以插入式和静电引力结合, 在核酸表面聚集增强了RLS信号。该方法灵敏度比四苯基钴卟啉高。 第三,μ-氧代双四苯基卟吩合铁RLS法测定核酸。μ-氧代双四苯基卟吩合铁中铁原子 除与氮原子配位外还结合氧原子,分子具有良好的刚性平面结构。小牛胸腺DNA、鱼精 DNA和酵母RNA的线性范围分别为0.02-2.5 μg ml~-1、0.02-2.7μg m1~-1、0.03-3.1μg ml~-1, 检测限分别为1.0 ng m1~-1、1.1 ng ml~-1、1.2 ng ml~-1。该方法灵敏度比单核金属卟啉高。 第四,甜菜碱型两性离子表面活性剂椰油酰胺丙基-2-羟基-3-磺基丙基甜菜碱 RLS法测定DNA。两性离子表面活性剂阴阳离子基团与核酸作用生成了大体积的超分子 化合物,促使了光散射信号的增强。小牛胸腺DNA的线性范围是0.02-4.25 μg ml~-1,检测 限为1.5 ng ml~-1。与阳离子表面活性剂法比较,该方法线性范围宽,检测限更低。 第五,钼酸铵RLS法测定蛋白质。 钼酸铵与蛋白质在适宜条件下结合,形成新型超分 子化合物。散射粒子分子量的增大及超分子化合物的憎水性增强了光散射信号。牛血清白 蛋白和人血清白蛋白的线性范围分别为0.25-8.5μg ml~-1、0.40-10.2μg ml~-1,检测限分别为 12.5 ng ml~-1、14.4 ng ml~-1。人尿和人血清中蛋白质的含量测定结果与考马斯亮蓝法接近。 第六,磷钨酸RLS法测定蛋白质。磷钨酸与蛋白质结合后,阴离子表面活性剂十二烷


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