何首乌芪合酶基因（FmSTS）的克隆、鉴定及转化拟南芥研究

【摘要】：何首乌[Fallopia multiflora(Thunb.)]属于蓼科多年生缠绕草本植物,其块根(何首乌)和藤茎(夜交藤)都可作药用。何首乌提取物中含有许多对人类健康有益的活性成分,其中最重要的是二苯乙烯苷等芪类化合物。研究证实,二苯乙烯苷在降血脂、抗衰老、保护心血管及抗动脉粥样硬化方面都有很好的应用前景。然而,有关何首乌中芪类化合物生物合成途径的研究还未见报道。 已有研究表明白藜芦醇等三羟基芪类物质是经苯丙氨酸途径由芪合酶(stilbene synthase,STS)催化合成,而何首乌中二苯乙烯苷等四羟基芪是否同样由STS催化合成还未见文献报道。为了深入研究何首乌中芪类化合物的生物合成途径,并为今后利用基因工程技术提高二苯乙烯苷类的含量奠定基础,本课题针对何首乌中的STS基因展开研究。首先运用同源扩增和RACE技术获得何首乌中STS基因的全长cDNA序列,并通过原核表达后酶催化反应对该基因表达的重组蛋白进行了功能鉴定;随后,将该基因转化拟南芥,检测到转基因植株中有芪类物质——白藜芦醇苷产生,证实FmSTS基因在植物体内能够催化芪类物质的合成。这将有助于深入研究FmSTS基因在何首乌芪类次生代谢产物生物合成途径中的功能。本文的主要研究结果如下: (1)为了避免何首乌RNA提取过程中多糖、多酚类物质的污染,对常规CTAB法进行了部分改良。结果,改良CTAB法提取的何首乌各组织RNA产量较高,纯度和完整性都较好,可以用于后续的RT-PCR、RACE扩增以及Northern blot分析。 (2)根据STS的保守区氨基酸序列设计引物,首次采用RACE技术从何首乌中分离到STS全长cDNA序列,将其命名为FmSTS,Genebank登录号为GQ411431。序列分析发现,FmSTS基因编码的蛋白序列含有379个氨基酸,分子量为41.25 kDa,等电点为5.90。该蛋白序列与蓼科植物虎杖、大黄的STS序列同源性都较高,且含有STS家族绝对保守的Cys-His-Asn催化活性中心结构。 (3)克隆了FmSTS的全长基因序列,Genebank登录号为GQ411432。与其cDNA序列比较后发现,FmSTS基因含有三个内含子,这一结构在STS家族中非常少见,因为STS家族基因结构相当保守,大多数基因都只在Cys60的位置含有一个内含子。Southern blot分析表明,FmSTS基因在何首乌基因组中至少含有3个不同的等位基因,是一个多基因家族。 (4)为了对FmSTS基因进行鉴定,将其插入原核表达载体pET-28a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3)进行表达。SDS-PAGE电泳结果显示,重组FmSTS蛋白分子量约为42 kDa,主要以包涵体的形式存在。通过优化表达条件,得到了可溶性的重组蛋白。经Ni-NTA琼脂糖凝胶亲和纯化后,重组FmSTS蛋白具有天然芪合酶的活性,能够催化丙二酰-CoA和香豆酰-CoA反应合成白藜芦醇。另外,利用葡萄STS抗体,对重组FmSTS蛋白进行了Western blot分析。结果抗体能够与重组蛋白特异结合,而只转化pET-28a(+)空载体的对照菌体蛋白没有杂交信号,从而在免疫学角度也证实了我们克隆的FmSTS基因确实是STS基因。 (5)为了进一步研究FmSTS基因在植物体内的代谢功能,构建了含有CaMV 35S组成型启动子的植物表达载体pCAM-FmSTS,并通过农杆菌介导的花序浸泡法转化拟南芥。经过潮霉素抗性筛选、基因组PCR以及RT-PCR,证实FmSTS基因已经整合入拟南芥的基因组中,并能够正常的转录和表达。经高效液相色谱分析和质谱鉴定,多数转基因植株中均能够产生芪类物质——白藜芦醇苷,最高含量达65.3μg /g拟南芥鲜重。 (6) FmSTS基因在何首乌中的转录具有组织特异性,在块根和老藤中表达量较高,在幼嫩的茎叶中表达量较低,而在老叶中几乎没有表达。这种转录模式与HPLC测得的二苯乙烯苷在何首乌各组织中的分布模式一致,表明FmSTS基因可能在二苯乙烯苷的生物合成途径中起一定的作用。