收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

由IOEP法和pAOX-HT载体介导的高效毕赤酵母表达流程的建立

王文凯  
【摘要】:脂肪酶是一种重要的工业用酶,在各个领域获得了广泛的应用。随着脂肪酶应用领域的扩大,开发新型高效的脂肪酶和提高脂肪酶的产量已成为酶制剂行业关注热点之一。为了满足这一需求,建立一个高效的获取脂肪酶基因并且验证其基因表达产物活性的技术流程是非常必须的。本论文中,我们建立了全基因合成方法流程及高效毕赤酵母表达载体,并通过解脂酵母YL2脂肪酶基因验证了该流程的高效性。本文的结果如下: (1)全基因合成方法的建立。在已有的基因合成方法基础上,提出一种低成本,低错误率,重复性好的基因合成方法-IOEP(Improved overlap extension PCR)法。该方法拆分的单链寡核苷酸长度为60nt左右,重叠区碱基数13-17bp,Tm值为40-50℃。合成过程采用DA-PCR、OE-PCR两步法合成。对于合成基因测序后的突变,利用寡核苷酸覆盖法进行修复。研究中利用IOEP法合成了10条长度为731-1511bp的基因,其平均化学合成成本率为1.291,平均错误率为1.031‰,相比已有方法都有所改善。 (2)高效表达的毕赤酵母表达载体的构建。由于毕赤酵母表达系统可分泌表达可溶性蛋白,因而选取其作为表达系统。对毕赤酵母表达载体pPIC9K添加XcmI酶切位点等操作,改造为pAOX-HT-BSK质粒。该载体可以实现T/A克隆,可直接克隆PCR产物;N段设计有His标签,可通过亲和层析方法纯化重组蛋白。并通过AflII酶切连接产物,进一步提高基因的克隆效率。通过克隆calb基因来验证pAOX-HT载体的效率,结果发现,T/A克隆后的蓝斑率为2.6‰,正向连接阳性克隆的效率达到了80%以上,而且CALB在毕赤酵母表达系统中正确表达,目的蛋白可通过Ni柱快速纯化。 (3)耶氏酵母YL2脂肪酶基因人工合成、克隆及在毕赤酵母中表达。为了验证IOEP全基因合成及利用pAOX-HT载体克隆表达的效率,人工全基因合成了yl2基因,并在毕赤酵母中表达了YL2脂肪酶,通过过亲和层析获得了纯度为90%以上重组脂肪酶。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 李招发;于学玲;黄金路;方宏清;陈惠鹏;;重组巴曲酶在毕赤酵母中的高效表达[J];生物工程学报;2007年03期
2 何成;蔡蓓蓓;楼觉人;;多拷贝重组HBsAg质粒的构建及在毕赤酵母中的高效表达[J];中国生物制品学杂志;2008年03期
3 韩冬;徐煌;张新民;姜爽;张婷;关铭;颜炜群;;rhHSP110毕赤酵母工程菌的大规模发酵及产物纯化[J];吉林大学学报(医学版);2008年03期
4 马团;宇丽;李发涛;周羽竝;;采用反向PCR技术优化适合毕赤酵母表达的截短型HPV58型L1基因[J];暨南大学学报(自然科学与医学版);2009年06期
5 黄锟;赵玉凤;赵锦;雷明科;林宏楠;王存文;吴元欣;;人乙醛脱氢酶2基因在毕赤酵母SMD1168中的表达研究[J];中国医药生物技术;2010年01期
6 孙晓璐;张平静;汪成富;冯丽萍;樊小英;李忠明;;毕赤酵母对不同细菌抗原的差异性表达[J];南昌大学学报(理科版);2011年03期
7 王跃祥,官孝群,杨健,莫炜,宋后燕;重组人血管内皮细胞生长因子121cDNA的基因克隆、表达和鉴定[J];生物化学与生物物理进展;2002年03期
8 赵菁菁,茹炳根;山蛭素(haemadin)在毕赤甲醇酵母中的表达及其性质鉴定[J];北京大学学报(自然科学版);2005年04期
9 姚钰舜;储炬;杭海峰;庄英萍;张嗣良;;培养条件对重组毕赤酵母高密度表达猪胰岛素前体的影响[J];华东理工大学学报(自然科学版);2006年04期
10 ;生物工程学报2006年第22卷总目次[J];生物工程学报;2006年06期
11 余祖华;王红宁;周生;黄勇;丁轲;;禽传染性支气管炎病毒S1基因毕赤酵母表达载体的构建[J];中国家禽;2006年21期
12 韦雪芳;林育泉;周鹏;;人碱性成纤维细胞生长因子(hu-bFGF)在毕赤酵母中的分泌表达[J];药物生物技术;2007年05期
13 周利苹;张莲芬;雷楗勇;张文婷;蔡燕飞;金坚;;人血清白蛋白-C肽融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达[J];生物技术通报;2008年03期
14 邹敏;储炬;;基因重组毕赤酵母表达瑞替普酶过程中的酶活性分析[J];南方医科大学学报;2008年09期
15 平续斌;李志敏;叶勤;黄秀东;曹之舫;;甲醇流加策略对重组毕赤酵母表达人肝再生增强因子的影响[J];中国医药工业杂志;2008年11期
16 陈佩新;高松;王书生;徐海华;黄秀东;;在毕赤酵母中表达的重组疟疾疫苗(PfCP-2.9)的纯化研究[J];中国高新技术企业;2010年13期
17 周倩;高必达;王锡锋;;商陆抗病毒蛋白重组子筛选及发酵条件初探[J];生物技术;2010年04期
18 黄火清;罗会颖;柏映国;王亚茹;姚斌;;来源于柠檬酸杆菌的高比活植酸酶基因在毕赤酵母中的高效表达[J];微生物学报;2006年06期
19 金虎;肖杰;段生兵;郑志永;史仲平;;毕赤酵母流加培养诱导生产植酸酶的流加控制策略[J];食品与发酵工业;2006年10期
20 骆诗鸿;;巴斯德毕赤酵母高效表达外源蛋白的策略[J];海峡药学;2007年02期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 王黎霞;张鹏;安健;;海兰灰蛋鸡粒细胞巨噬细胞集落素刺激因子的毕赤酵母表达及活性鉴定[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第六次代表大会暨第十一次学术研讨会论文集[C];2011年
2 蒲广西;邓刚;符启骄;周湘龙;符兆理;陈海宁;郝新保;白玉杰;梁国栋;;毕赤酵母发酵生产重组人粒细胞集落刺激因子[A];海南生物技术研究与发展研讨会论文集[C];2006年
3 史宝军;崔细鹏;陈丽芝;吕东海;周镇锋;;毕赤酵母表达的木聚糖酶的分离纯化及其性质研究[A];动物营养与饲料研究——第五届全国饲料营养学术研讨会论文集[C];2006年
4 储炬;陈文;郭美锦;杭海峰;庄英萍;张嗣良;;重组毕赤酵母表达猪胰岛素前体代谢参数分析和动力学模型[A];第一届全国化学工程与生物化工年会论文摘要集(下)[C];2004年
5 王波;苏丽;张玉华;魏广智;王广义;王字玲;;血小板糖蛋白GPIbavWF结合域在酵母中的表达鉴定[A];第三届全国血液免疫学学术大会论文集[C];2003年
6 高兴春;郭敏;徐梅倩;何国声;;用毕赤酵母表达皮蝇素C蛋白的研究[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第九次学术研讨会论文摘要集[C];2006年
7 张秋伟;陈书明;;外源基因在毕赤酵母中表达的影响因素及优化策略[A];全国动物生理生化第十次学术交流会论文摘要汇编[C];2008年
8 粟宽源;陈文吟;郑业华;余宙耀;;人源抗-HBs抗体在毕赤酵母中的高密度表达[A];中华医学会第十二次全国病毒性肝炎及肝病学术会议论文汇编[C];2005年
9 王爽;齐俊生;王琦;梅汝鸿;;蜡样芽孢杆菌M22超氧化物歧化酶(SOD)基因在毕赤酵母中的表达及其发酵条件优化[A];中国植物病理学会2005年学术年会暨植物病理学报创刊50周年纪念会论文摘要集[C];2005年
10 刘一尘;张春杰;程安春;程相朝;汪铭书;李银聚;吴庭才;易明林;;NDV HN基因的毕赤酵母表达及免疫原性分析[A];第四届第九次全国学术研讨会暨饲料和动物源食品安全战略论坛论文集(下册)[C];2008年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 路英丽;人腺激肽释放酶2的重组表达、活性测定及临床应用研究[D];吉林大学;2006年
2 刘朔;纳豆激酶基因密码子优化设计与合成及在毕赤酵母中的高效表达[D];南京农业大学;2007年
3 周小霞;东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶基因克隆及其功能研究[D];重庆大学;2009年
4 韩飞;基因重组毕赤酵母表达阿片肽对小鼠免疫作用及其机制研究[D];江南大学;2005年
5 王淑豪;人肝脯氨肽酶基因的克隆表达及其生化药理学性质[D];中国人民解放军军事医学科学院;2003年
6 李殿明;新型猪瘟黏膜疫苗及检测试剂盒的研究[D];中国海洋大学;2008年
7 孔宁;重组人OSM的制备及诱导肝癌细胞分化的实验研究[D];吉林大学;2009年
8 林景卫;真菌免疫调节蛋白(FIP)在毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中的重组表达及其生物学活性的研究[D];东北师范大学;2009年
9 王庆杰;新型毕赤酵母表面展示系统的构建及表达研究[D];山东大学;2008年
10 黄岩山;重组人血清白蛋白—干扰素α 2b融合蛋白的研究[D];浙江大学;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 王文凯;由IOEP法和pAOX-HT载体介导的高效毕赤酵母表达流程的建立[D];华南理工大学;2011年
2 张璟;人可溶性晚期糖基化终产物受体的毕赤酵母表达及其发酵工艺研究[D];暨南大学;2010年
3 陈京顺;色氨酸羟化酶-2在大肠杆菌中的表达及其毕赤酵母表达菌株的构建[D];北京化工大学;2011年
4 凡炼炼;人SLPI cDNA的克隆及在毕赤酵母中的表达[D];吉林大学;2006年
5 张倩;透明颤菌血红蛋白的表达提高毕赤酵母的菌密度和TNFRⅡ-FC融合蛋白的产量[D];中国人民解放军军事医学科学院;2008年
6 陈勇;重组毕赤酵母表达水蛭素的发酵工艺研究[D];重庆大学;2007年
7 李卓夫;葡萄糖氧化酶基因的克隆及高效表达[D];长春理工大学;2008年
8 陈炜烨;人IL-1R Ⅰ胞外区毕赤酵母表达载体的构建和表达[D];广州中医药大学;2010年
9 孙怡;用毕赤酵母表达皮蝇素A蛋白的研究[D];中国农业科学院;2005年
10 张田;利用毕赤酵母表达小C肽人胰岛素原的研究[D];上海交通大学;2008年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978