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产纤溶酶菌DC-YJ11的筛选鉴定、混合发酵优化及纤溶酶的分离纯化

刘彩平  
【摘要】:豆豉是中国传统的大豆发酵制品,从中提取出一种具有纤溶活性的酶——豆豉纤溶酶,它是一种具有纤维蛋白水解活性的双链丝氨酸蛋白酶。与链激酶、尿激酶等传统溶栓剂相比,豆豉纤溶酶具有纤溶效果强、安全性高、作用迅速、药效持久、价格低廉等优点。受日本研究人员从纳豆中分离筛选得到产纳豆激酶菌种的启发,我国的科学工作者从豆豉中分离出多株产豆豉激酶的菌种。 本文使用平板法,从产自广东、四川、北京、重庆四地的9种豆豉中筛选出138株具有豆豉纤溶酶活性的菌株,对其中酶活最高的DC-YJ11进行了菌种鉴定,建立了该菌株基于BP神经网络的生长模型,优化了混合培养产纤溶酶的培养基,并对所产纤溶酶进行了初步的分离纯化,结论如下: 1.使用酪蛋白平板初筛、纤维蛋白板复筛的方法从9种豆豉中分离得到了138株具有纤溶酶活性的微生物,证明该筛选方法是可行的。 2.通过形态特征观察和生理生化试验以及16SrDNA分子鉴定方法对DC-YJ11进行鉴定。该菌株的形态特征和生理生化特征与枯草芽孢杆菌相符,16SrDNA序列的同源性达99.83%。因此,此菌株被鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。 3.使用BP神经网络法建立了DC-YJ11的生长模型。经验证该网络模型能够准确地反映该菌的生长状况,与传统的回归建模方式相比,BP神经网络法明显地降低了误差,均方误差0.336,提高了准确度。 4.使用响应曲面法对混合培养生产豆豉纤溶酶的培养基进行了优化,其最优培养基为:麦芽糖10.39g/L、牛肉膏2.62g/L、大豆蛋白胨28.74g/L。在此条件下,酶活为156.15U/mL,与优化前相比,酶活提高了22.73%。 5.采用硫酸铵盐析、超滤脱盐和SephadexG-75凝胶层析方法对DC-YJ11所产的纤溶酶进行了纯化,最终纯化倍数26.97倍,回收率13.78%。酶的表观分子量为30kDa。


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