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单纯疱疹病毒Ⅱ型LAT基因开放读码框3抗细胞凋亡作用的研究

薛礼长  
【摘要】:单纯疱疹病毒Ⅱ型(Herpes Simplex VirusⅡ,HSV-2)是一种常见的人类病毒性疾病病原体,主要引起生殖器疱疹(genital herpes,GH)。HSV-2侵染人体后不但引起原发性感染,并可在骶尾神经节内以休眠的状态建立潜伏感染。这种潜伏往往是终生的,并伴随体内外各种非特异性刺激而活化,导致相关临床症状复发,造成复发感染。正因为这种潜伏复发机制导致HSV能够逃避免疫系统的消灭而难以根除。目前尚不明确单纯疱疹病毒的潜伏复发机制,这是临床上彻底治愈HSV-2感染的瓶颈所在。 潜伏相关转录体(Latency associated transcript,LAT)是HSV潜伏感染期间唯一大量存在的转录物,多年的研究表明LAT在HSV潜伏的建立、保持和活化过程中起着不可替代的作用。 学者们对LAT功能的研究,虽然已提出多种假说,但争议很大。HSV-2 LAT含有三个开放读码框(Open Reading Frame,ORF),有研究指出LAT的开放读码框可以编码抗凋亡作用的蛋白来抑制其宿主细胞的凋亡,从而保持HSV-2的潜伏感染状态。 据此,本研究构建了重组真核表达载体pEGFP-ORF3。将重组质粒pEGFP-ORF3转染Vero细胞后,研究其在Vero细胞中表达及抗顺铂诱导的凋亡作用。 首先,以HSV-2 333株基因组为模板,PCR扩增获得LAT ORF3序列,PCR产物和质粒pEGFP-C2经EcoRI、KpnI双酶切后,T4连接酶连接,连接产物转化大肠杆菌TOP10菌株,经抗性筛选后获得重组质粒pEGFP-ORF3,双酶切及测序鉴定重组质粒pEGFP-ORF3构建成功。Xfect转染试剂介导pEGFP-ORF3转染Vero细胞,48h后将细胞放在倒置荧光显微镜下,观察绿色荧光蛋白标记的ORF3片段的表达,RT-PCR确定其mRNA在Vero细胞中转录成功。 重组质粒pEGFP-ORF3转染Vero细胞后,荧光显微镜观察到ORF3在细胞中高效表达;融合蛋白在细胞质中的分布量要显著少于细胞核中。本实验使用常见诱导剂顺铂对各组细胞进行凋亡诱导后,通过倒置荧光显微镜下观察各组细胞的形态特征及Giemsa染色观察细胞核的变化,发现转染重组质粒pEGFP-ORF3的细胞与正常细胞无显著差异;MTT法分析细胞增殖情况与正常细胞无差异而显著高于空质粒组;流式细胞术检测凋亡率与正常细胞无显著差异,而显著低于空质粒组。 这些研究结果表明,HSV-2 LAT ORF3具有抵抗顺铂诱导的Vero细胞凋亡的功能。本研究构建的重组真核表达载体pEGFP-ORF3能在Vero细胞内高效表达,并证实了其抗细胞凋亡的功能,为进一步研究HSV-2 LAT介导的潜伏复发机制奠定了一定的实验基础。


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