脂肪酶的新型毕赤酵母表面展示及其在非水相催化中的评价

【摘要】：随着微生物表面展示技术的发展,越来越多的外源蛋白在微生物表面展示。微生物表面展示体系广泛应用在生物学研究及工业生产的许多领域,例如研究蛋白质与蛋白质之间的相互识别与相互作用、由多肽构象或蛋白质突变库中获取特定功能蛋白、生产抗体、生产口服疫苗、开发全细胞催化剂、开发生物传感器、开发细胞吸附剂等,成为竞相研究的热点。 在众多的微生物展示体系中,酿酒酵母表面展示体系发展较快,多种不同的酿酒酵母细胞壁蛋白应用于酿酒酵母表面展示体系,这些壁蛋白大都是共价或者非共价的与细胞壁结合。 外源蛋白在酿酒酵母中表达时它对外源蛋白N-糖基化修饰形式是高甘露糖型,糖链平均为50~150甘露糖残基,过糖基化可能影响外源蛋白的活性。与酿酒酵母不同的是毕赤酵母对外源蛋白的修饰是低甘露糖型,糖链平均为8~14甘露糖残基,而且毕赤酵母可以进行高密度发酵。目前已经利用来源于酿酒酵母锚定蛋白开发的毕赤酵母表面展示体系。为了丰富毕赤酵母展示体系,展示不同需要的外源蛋白,本文做了如下的工作: ①通过PCR扩增米黑根毛霉脂肪酶基因,在米黑根毛霉脂肪酶N端加入FLAG标签。将米黑根毛霉脂肪酶基因与酿酒酵母细胞壁蛋白Sed1p基因的N端融合构建质粒pKRML-Sed1,转化毕赤酵母GS115获得重组菌GS115/pKRML-Sed1。重组菌经过甲醇诱导表达后,荧光显微镜与流式细胞仪检测结果均证实米黑根毛霉脂肪酶已经成功展示在毕赤酵母上。该重组菌水解活力达到169.6 U/g (Dry cell weight)。 ②我们将酿酒酵母细胞壁蛋白Sed1p与毕赤酵母全基因组进行序列比对,发现了两个未知功能蛋白与Sed1p有同源性,并通过一个GPI型蛋白预测软件对其进行预测,发现了其中一个未知的蛋白是一个潜在的细胞壁蛋白,我们将它命名为Gcw14p,我们将Gcw14p在毕赤酵母中表达,荧光显微镜与流式细胞仪的结果显示Gcw14p成功的锚定在细胞壁上,Western Blot分析的结果显示Gcw14p共价结合在毕赤酵母细胞壁上,由此证明Gcw14p是毕赤酵母GPI型细胞壁蛋白。 ③我们利用全新的毕赤酵母细胞壁蛋白Gcw14p构建了毕赤酵母展示体系,南极假丝酵母脂肪酶B与Gcw14p的N端融合,融合蛋白CALB-Gcw14在毕赤酵母甲醇启动子(AOX1)的诱导下表达,流式细胞仪、荧光显微镜与Western Blot的结果显示南极假丝酵母脂肪酶B已经成功的展示在毕赤酵母表面。 ④将构建的新菌株GS115/pKRML-Sed1与GS115/pKCALB-Gcw14制备全细胞催化剂,在非水相中对两种全细胞催化剂的活力进行评价, GS115/pKRML-Sed1催化脂肪酸甲酯的合成在反应72 h后脂肪酸甲酯的产率达到82.36%,GS115/pKCALB-Gcw14催化己酸乙酯的合成,在反应1.5 h后己酸乙酯的产率达到96%,说明新构建的毕赤酵母表面展示脂肪酶在非水相中具有较好的活力。