蚕蛹抗氧化多肽的制备及分离纯化研究

【摘要】：人类许多慢性疾病及衰老现象均和人体内的自由基水平失衡有关,外源性抗氧化剂可以帮助人们维持体内自由基的平衡。通过对具有抗氧化活性的天然食物进行研究、筛选和改性有可能开发出有效的抗氧化药物和保健食品蚕蛹蛋白是一种优质蛋白质资源,含有18种氨基酸,其中8种人体必需氨基酸含量超过氨基酸总量40%,其蛋白含量约为50%,是一种比大豆蛋白更具营养价值的优质蛋白质资源 本论文研究了蚕蛹蛋白粉的提取,酶解工艺条件,多肽抗氧化活性的检测方法,以及蚕蛹多肽中具有DPPH·清除活性的多肽的分离纯化。 1.蚕蛹蛋白粉的脱脂及前处理。选取常规溶剂正己烷,丙酮,乙酸乙酯,无水乙醇分别作为单一脱脂溶剂做脱脂优化,以脱脂率为指标,得到最佳脱脂溶剂为丙酮。以超声细胞破碎法,微波破碎法,去离子水浸泡法三种方法对蛋白粉进行破碎处理,以上清液中蛋白含量为指标,得到最佳的破碎处理条件为超声波100HZ,间隔2sec,破碎10min 2.建立了蚕蛹多肽体外抗氧化活性的检测方法。检测了蚕蛹蛋白水解液的抗氧化能力,包括清除超氧阴离子、清除羟自由基、清除DPPH·、还原能力和防止脂质过氧化等方面的能力。实验结果表明蚕蛹蛋白酶解液在不同检测系统中均具有抗氧化能力,尤以对DPPH·清除活性最高,具有很好的开发利用前景。 3.确定了蚕蛹蛋白进一步酶解的最佳工艺条件。以DPPH·清除活性为指标,经过单酶实验,得到最佳水解用酶:胃蛋白酶。经过L16(45)的正交试验,确定了胃蛋白酶的最佳酶解条件:50℃,pH1.5,加酶量为8000U/g,酶解时间6h,底物浓度为4%。 4.以DPPH·活性为指标,分离纯化了蚕蛹多肽。确定了Sephadex G-25凝胶层析对蚕蛹多肽的最佳分离条件:洗脱液为去离子水,0.2mL/min的洗脱速度,10mg/mL的上样浓度,0.50mL上样量,此时蚕蛹多肽能被分离出3个峰,其中第3峰具有最高的DPPH清除能力。使用DEAE填料进行离子交换,第三峰分为五个峰,其中A峰DPPH·清除能力最高。A峰的HPLC分析进一步表明其为是单一的物质,通过质谱分析得到其为含酪氨酸基团分子量为892Da的基团。质谱分析得到这是一种含tyr的分子量为892的多