集胞藻PCC6803中蛋白酶Slr0643的功能分析

【摘要】：在膜蛋白的受控切割是一个通过膜整合蛋白酶切割底物跨膜区域来调控跨膜信号转导的保守机制。二位蛋白酶site2protease（S2P）作为第一个被鉴定的参与到该机制的膜蛋白酶，在过去的十年中得到了广泛的研究，不同物种中鉴定了更多的该金属蛋白酶家族的成员。但是这些二位蛋白酶的底物和参与到一位切割的site1protease（S1P）仍然不清楚。在光合生物中尚未见有关S2P信号转导报道，本论文选取基因组较小且遗传操作较为简单的光合作用蓝藻Synechocystis sp. PCC6803作为模式，系统研究了S2P同源蛋白Slr0643的功能及调控。 主要结果如下：1.通过分析大量的S2P级联信号转导的详细信息，总结了S2P级联信号转导的保守性和变异性。探讨了不同种蓝藻中S2P同源蛋白的分布及其进化关系。2.通过对本实验室已有的Synechocystis sp. PCC6803slr0643基因破坏突变体和野生型进行的详尽的生理学分析，包括低温叶绿素荧光、常温叶绿素荧光和放氧速率等，发现在正常生长条件下（pH7.5）,突变体均可以正常生长，但是在pH6.5时突变体的光合系统Ⅱ活性受到严重影响，从而导致突变体生长停滞。3.利用基因芯片分析和实时荧光定量PCR分析野生型和突变体在不同pH条件下基因转录变化，发现野生型中slr0643转录本在pH由7.5降到6.5后15min上调2倍以上。而且野生型和突变体中参与到酸压力响应早期过程的基因转录具有显著差异。其中一个较为重要的基因簇SigH(sll0856-sll0857-sll0858)受到酸压力诱导转录，但是在突变体中该簇基因完全丧失对酸压力的响应能力。结合上述结果的分析，我们推测Slr0643是通过切割anti-sigmaH(sll0857)来调控酸压力响应基因。4.制备了Slr0643的多克隆抗体，探索了集胞藻中S2P同源蛋白在大肠杆菌中异源表达条件，发现利用pGEX-2T载体构建slr0643重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3) C43，在22℃培养以0.4mM IPTG诱导12小时获得了大量表达，并以β酪蛋白为底物在体外鉴定了Slr0643的金属蛋白酶活性。 上述研究结果不仅为以后研究Slr0643基因家族成员的具体调控和功能奠定了坚实的基础，也为研究光合生物中S2P的功能提供了重要启示。