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南极假丝酵母脂肪酶A酶学性质及油脂催化应用研究

杨春芳  
【摘要】:脂肪酶是一种重要的生物催化剂,在食品、医药等工业应用中非常广泛,相对于化学催化剂具有诸多的优点,如反应条件温和、无污染、有特异的选择性等。南极假丝酵母能产生两种脂肪酶,分别是脂肪酶A(CALA)和脂肪酶B(CALB)。CALB作为一种常用的生物催化剂,已经对其进行了大量的研究,在生物催化领域也得到了广泛的应用;而对于CALA的相关研究及应用相对较少。CALA具有很多优于其他脂肪酶的性质,本文对CALA的基本酶学特性和有机溶剂对其活力和结构的影响进行了探讨研究,并对CALA在油脂催化中的基本应用进行了研究,主要研究内容及结果如下: 1.对重组并纯化后的CALA的酶学特性研究表明:CALA最适宜的反应温度为70℃,在50℃-70℃保温处理2h,水解活力可以保留原始活力的60%;最适宜的pH值为9.0,在pH7.0~9.0溶液中比较稳定。通过水解大豆色拉油的实验结果显示,CALA具有一定的位置选择性,更倾向于水解甘油酯Sn-2位脂肪酸;随着反应程度的加深,水解所得的Sn-1,3甘油二酯含量(12.35%)增加,而Sn-1,2甘油二酯含量(5.26%)降低。考察CALA对不同脂肪酸组成的甘油三酯的水解效果,发现CALA对不同甘油三酯的水解率具有很大的差异,这可能与CALA对脂肪酸链长度的特异性有关:即CALA对短链脂肪酸具有更好的水解特性,长链的相对较弱,对棕榈酸(C16:0)的甘油三酯基本没有水解活力。 2.考察了不同有机溶剂对CALA水解及酯化活力的影响,结果显示:经乙腈处理的CALA水解活力提高为原酶的1.08倍,而乙腈和丙酮处理后CALA酯化活力分别提高至原酶的1.31倍和1.24倍;其余常用有机溶剂处理后酶活均明显降低,尤其是使用无水乙醇和乙酸乙酯处理后,CALA的水解活力仅为原酶的17.15%和18.06%。此外,经相同溶剂处理之后的CALA酯化活力均高于其水解活力。通过傅里叶变换红外(FT-IR)光谱仪对有机溶剂处理前后的CALA蛋白结构进行了研究,结果显示CALA活力变化主要是因为溶剂处理引起酶蛋白二级结构的改变。基于乙腈处理能一定程度提高CALA活力,研究了乙腈处理前后CALA最适pH值和温度的变化,结果表明乙腈处理能提高CALA热稳定性和pH值稳定性。 3.探讨了CALA在油脂催化中的各种催化效用,包括催化油脂酸解,甘油三酯的水解,甘油及小分子乙醇分别与脂肪酸的酯化等。并基于CALA催化乙醇与共轭亚油酸(CLA)两异构体酯化的选择性,对CALA和Novozyme435联合催化CLA异构体拆分进行了进一步的研究,确定最佳的工艺条件为:无溶剂体系中酯化反应pH8.0,CLA与无水乙醇的摩尔比为1:2,CALA的酶加量为CLA质量的的5%,Novozyme435的加入量为CLA质量的2%,50℃条件下反应3h,得到的总酯化率达52.84%,t10,c12-CLA乙酯与c9,t11-CLA乙酯的百分含量比可以达到3.27:1。


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