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氨基葡萄糖功能化水凝胶的构建及介导BMSCs成软骨分化的研究

王群芳  
【摘要】:软骨由于无血管、淋巴、神经等特殊的生理学特点,自身修复能力有限,直径大于4mm的缺损一般不能自行修复,软骨缺损一直是临床尚未解决的难题。组织工程技术的出现为这一问题的解决提供了可行的方案。生物材料支架是组织工程技术的构成要素之一,需具备协同细胞因子介导细胞增殖分化的功能,为细胞生长提供一个适宜的微环境。基于此,本研究从氨基葡萄糖单糖出发,构建一个带有多糖链的仿生凝胶,通过氨基葡萄糖基团与细胞表面的糖敏感受体的相互作用,实现凝胶与细胞间的相互交流,同时,通过糖基团与蛋白因子之间的相互作用,协同生长因子介导细胞增殖和分化,促进细胞外基质合成,分泌和加工,为种子细胞提供一个仿生智能微环境。软骨组织因其部位特殊,形状不规则,异位成型支架往往难与受损部位完全吻合,易造成支架脱落。原位成型支架则不受缺损部位形状、大小和深度的限制,可通过微创手术完成缺损部位修复,可以最大限度的减少患者的创伤和痛苦。本文采用紫外光交联技术,构建可原位成型氨基葡萄糖功能化水凝胶-骨髓间质干细胞复合载体,并对其体外介导骨髓间质干细胞生长、分化成软骨等行为进行系统的研究和探讨。 采用丙酮与水的混合介质为溶剂,无需保护和去保护步骤,一步合成不饱和氨基葡萄糖单体--N-丙烯酰氨基葡萄糖(AGA),同时,系统研究了所得产物AGA与蛋白质的相互作用,及其对骨髓间质干细胞(BMSCs)增殖、分化行为的影响。氨基被丙烯酰基取代的氨基葡萄糖--AGA可引起牛血清白蛋白(BSA)分子内荧光淬灭,而且随着AGA浓度增加,BSA荧光淬灭程度加剧。AGA引起BSA荧光淬灭属于静态淬灭机制,其结合常数ka=812.83l.mol-1,结合位点数为1。AGA的细胞毒性研究表明,外加AGA不影响BMSCs的生长代谢,但当AGA浓度达10mM时,轻度抑制BMSCs增殖。在成软骨诱导液和TGFβ3存在下,外加AGA可上调二维培养的BMSCs细胞表达CollagenⅡ,Aggrecan基因,但只有10mMAGA10上调SOX9基因的表达。阿利新蓝染色和免疫组化染色亦证实AGA组细胞质蓝色和Collagen Ⅱ褐色染色程度优于控制组和氨基葡萄糖(GLcN)组。 以I2959为引发剂,采用紫外光交联技术,探讨光引发剂浓度、AGA和聚乙二醇双丙烯酸酯(polyethylene glycol diacrylate, PEGDA)用量,PEGDA分子量,对可原位成型的AGA与PEGDA水凝胶溶胀率和交联产率的影响。核磁共振氢谱,傅里叶变换红外光谱和X射线光电子能谱结果证实,AGA、PEGDA中的碳碳双键形成以聚丙烯酸酯为动力学链的交联网状结构,成功将氨基葡萄糖单元引入PEGDA凝胶网络中。研究结果表明:引发剂质量浓度为0.06%时,AGA/PEGDA体系的交联产率最佳; AGA用量增加引起体系交联产率下降,而PEGDA用量增加体系交联产率呈先下降后升高的趋势;AGA和PEGDA用量的增加都会导致凝胶溶胀率下降,AGA用量的增加还将引起凝胶表面出现皱褶。在相同辐照条件下,低分子量的PEGDA带来高的交联产率,而高分子量的PEGDA带来高溶胀度的凝胶。AGA/PEGDA体系可通过调节AGA用量或选用不同分子量的PEGDA作为体系交联剂,调控含糖水凝胶的溶胀性能和交联凝胶化时间。 光交联体外构建AGA/PEGDA-BMSCs细胞原位成型复合载体,系统研究共价结合的氨基葡萄糖单元对三维培养的BMSCs形态,增殖和分化成软骨细胞的影响。研究表明:BMSCs成功封装在凝胶内,所用单体和光交联过程对细胞损伤极低,凝胶内细胞呈圆形,以一个或多个细胞的小聚集体分散在凝胶内。组织切片的H-E染色显示凝胶内细胞有类似软骨细胞的形态。AGA/PEGDA凝胶内氨基葡萄糖单元的存在可提高细胞DNA总量,凝胶内细胞代谢活性随AGA用量的增加而增加,5mM AGA/PEGDA和10mM AGA/PEGDA凝胶内代谢活力分别为起始种植量的60%和98%,远高于PEGDA凝胶内的30%。AGA/PEGDA凝胶可协同培养介质中生长因子TGFβ3,促进三维培养的BMSCs分化成软骨细胞,组织切片的阿利新蓝和Masson三色染色呈阳性,增加AGA/PEGDA体系中AGA用量,更有利于激活BMSCs成软骨特异基因SOX9,Aggrecan, CollagenII的表达,提高软骨特异基质糖胺聚糖(GAG)分泌量。 采用紫外光交联技术构建原位成型类多糖仿生凝胶,此过程无需单糖官能团的保护和去保护步骤,该技术为从单糖出发制备含糖聚合物,提供了一种新型而简捷的方法。凝胶内氨基葡萄糖单元的存在,可与周边环境中的蛋白因子相互作用,模拟体内细胞的微环境,为生物活性支架设计提供了新的途径与思路。


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