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红曲色素的pH敏感性及低pH萃取发酵的代谢调控

石侃  
【摘要】:红曲色素是红曲霉(Monascus spp.)代谢生成的一类聚酮次级代谢产物,其作为一种天然食用色素在中国及其他许多东亚和东南亚国家有着悠久的应用历史。在食品安全日益受到重视的今天,由于红曲色素较高的安全性和颜色的多样性,使其作为食用色素具有广阔的应用前景。本研究从液态发酵红曲霉菌丝体中分离纯化获得了几种主要的红曲色素组分,探讨了各红曲色素组分的pH敏感性,包括光谱、颜色、反应特性及光降解等的敏感性;研究了发酵过程中pH及氮源对红曲色素代谢协同调控作用;并进一步分析研究了这些特性对红曲色素分析、应用及发酵调控的影响。本研究还深入探讨采用红曲色素高产菌Monascus anka GIM 3.592低pH萃取发酵中的红曲色素代谢规律及代谢调控;对比了萃取发酵及常规液态发酵红曲色素HPLC指纹图谱差异;最后将萃取发酵和固定化细胞发酵结合起来实现了胞外黄色素的连续生产。结论如下:(1)橙色素(rubropunctatin和monascorubrin)和红色素(rubropunctamine和monascorubramine)的光谱及颜色特征对溶剂pH非常敏感。随pH的增高,橙色素光谱出现明显的红移,pH越高红移程度越大,其颜色特征从黄色变为橙色,再变为红色,最后变为紫色,而红色素光谱则出现明显的蓝移,颜色特征从深红变为淡红。但黄色素(monascin和ankaflavin)和水溶性红色素(N-glutarylrubropunctamine和Nglutarylmonascorubramine)的可见光下光谱及颜色特征对溶剂pH不敏感,其可见光光谱及颜色特征在所有实验溶剂pH下都很稳定。该结果可以为红曲色素基于溶剂pH的应用提供参考。橙色素与氨基化合物的亲氨反应也对溶剂pH敏感,随着溶剂pH的增加,橙色素亲氨反应速率迅速增加,橙色素逐渐反应变为对应的红色素。另外,pH敏感的红曲色素光谱特性及亲氨反应特性会严重影响基于特定波长吸光值的红曲色素浓度测定及基于光谱特征的红曲色素组成分析。因此,我们建议在红曲色素样品的制备和分析过程中应当控制溶剂pH≤2.5,以避免溶剂pH引起的红曲色素光谱变化及亲氨反应造成的新色素生成,从而确保分析结果能准确反应红曲色素样品的真实情况及样品间的真实差异。(2)红曲色素的光稳定性与溶剂pH密切相关。在实验条件下,橙色素(rubropunctatin和monascorubrin)和红色素(rubropunctamine和monascorubramine)在溶剂pH 2.5条件下具有较好的光稳定性,随溶剂pH的增高,光降解速率明显增加,颜色特征发生明显的变化。相比橙色素和红色素,黄色素(monascin和ankaflavin)和水溶性红色素(N-glutarylrubropunctamine和N-glutarylmonascorubramine)在各溶剂pH条件下总体都具有较好的光稳定性,光降解速率较慢,其颜色特征变化较小。因此,黄色素和水溶性红色素对溶剂pH适用的范围更广,在各溶剂pH下都能保证较好的光稳定性和稳定的颜色特征,而对于橙色素和红色素更适宜于低溶剂pH下应用,才能保证较好的光稳定性和稳定的颜色特征。(3)发酵过程红曲色素的组成受pH和氮源的协同调控。低pH条件下,红曲霉主要代谢积累胞内橙色素rubropunctatin和monascorubrin,与使用的氮源种类无关;高pH条件下,使用铵态氮做氮源,主要代谢积累胞内红色素rubropunctamine和monascorubramine;高p H条件下,使用有机氮做氮源,主要代谢积累胞内黄色素monascin和ankaflavin,同时生成大量的胞外水溶性红色素。红曲色素样品的颜色特征由其中的主要色素组分决定。因此,红曲色素发酵过程中,通过pH和氮源种类的选择,可以控制某一类色素的大量积累,从而控制红曲色素产品的颜色特征。(4)低pH下Monascus anka GIM 3.592常规液态发酵主要代谢积累胞内黄色素(monascin和ankaflavin)和橙色素(rubropunctatin和monascorubrin),而添加非离子表面活性剂的萃取发酵可以将胞内黄色素与橙色素萃取至胞外,同时还形成四种常规液态发酵没有的新黄色素,这四种新黄色素是胞外色素的主要组成成分,他们具有一致的紫外可见光谱和荧光光谱,紫外光谱具有430 nm的吸收峰,荧光发射光谱具有565 nm左右的吸收峰,在紫外激发光照射下,能发出强烈的橙色荧光。但使用单纯的非离子表面活性剂水溶液直接萃取新鲜细胞时,却只能将胞内黄色素和橙色素萃取出来,无法生成四种新黄色素。通过比较不同萃取发酵过程中各个色素的代谢积累情况和新色素与橙色素间分子量差异,证实四种新的黄色素可能是在胞内色素被萃取至胞外的过程中由橙色素rubropunctatin和monascorubrin分别转化生成的。同时胞外色素的产量随非离子表面活性浓度的增高而增高,非离子表面活性的添加时间也影响胞外色素产量,与在发酵前期和后期添加相比,在发酵中期添加非离子表面活性的胞外色素产量最高。(5)低pH下的萃取发酵可以很好地与固定化细胞相结合,可以实现胞外黄色素的连续发酵生产。固定化细胞萃取发酵可以显著提高细胞密度并明显缩短发酵时间,固定化细胞重复利用性好,可以至少使用7个批次。反复分批固定化细胞萃取发酵中,4批次(13天)的黄色素平均生产率可达22.31 AU410 nm/day,总黄色素产量为289.97 AU410nm;七批次(25天)的黄色素平均生产率可达19.70 AU410 nm/day,总黄色素产量为492.53AU410 nm。


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