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基于生物活性玻璃/壳聚糖/丝素蛋白的皮肤组织工程复合支架材料构建及其应用研究

李丹荣  
【摘要】:通过构建新型的皮肤组织工程支架材料,实现皮肤损伤创面尤其是难愈合缺损创面的快速愈合,有效恢复皮肤缺损部位的组织功能已经成为当今医学界和生物材料学界努力探索和试图解决的重要课题。生物活性玻璃(Bioactive glass,BG)、壳聚糖(Chitosan,CHI)、丝素蛋白(Silk fibroin,SF)均已分别应用于皮肤组织创面修复,并表现出了各自独特的优势,但仅使用单一材料往往在三维多孔结构、热稳定性、降解速率、生物活性成分以及生物活性因子的富集和保持等方面存在着缺陷和不足。对于将三种材料以适当的比例和工艺进行整合,从而克服上述单一材料的缺陷和不足方面的研究比较少。本论文围绕生物活性玻璃/壳聚糖/丝素蛋白复合支架材料的构建及其对皮肤创面修复机理进行研究,通过FTIR分析,扫描电镜技术、热稳定性分析、孔径和孔隙率测试,吸水性测试等手段对三维多孔复合支架材料的复合比例和制备工艺进行筛选和优化,并在体外将3T3成纤维细胞和支架材料复合培养,通过MTT法、免疫荧光染色技术测定观察复合支架材料对成纤维细胞增殖和迁移的影响,得到具有更优良的理化性能、更匹配的降解速率、更快速血管化能力的新型皮肤组织工程支架材料,利用大鼠全层皮肤缺损模型来模拟难愈创面的修复过程,通过大体观察、HE染色、Masson三色染色、免疫组化分析等进一步观察分析上皮细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞的增殖,计算分析创面愈合时间和愈合率以及新生血管和成熟血管相关特异性标记物(CD31和α-SMA)的表达,系统研究并证实了生物活性玻璃/壳聚糖/丝素蛋白(2:8)复合支架材料具有更优良的理化性能、更匹配的降解速率、更快速血管化能力、更短创面修复愈合时间和更高创面修复愈合率的新型皮肤组织工程支架材料。具体研究工作如下:首先,利用溶胶-凝胶法制备生物活性玻璃58S,利用冷冻干燥法制备出不同复合比例(1:9~5:5)的CHI/SF和BG/CHI/SF复合支架材料。通过对不同复合比例支架材料的孔径和孔隙率的测试,我们发现纯SF支架、CHI/SF(3:7)和CHI/SF(2:8)复合支架孔径处在100~120μm,孔隙率大于90%;而热稳定性测试结果显示CHI/SF(2:8)复合支架材料明显优于纯SF支架和CHI/SF(3:7)复合支架材料,同时,吸水性测试结果表明CHI/SF(2:8)复合支架材料的吸水指数(4.89±0.338)显著优于纯SF支架的吸水指数(1.12±0.104)。生物活性成分BG加入后,可以均匀分布于复合支架材料孔壁上,没有对SF基支架材料的孔径、孔隙率产生影响,相反,BG的加入,一方面增加了支架材料的热稳定性,另一方面,也使得支架材料的表面积和孔壁的粗糙度明显增加。综合研究之后,我们认为BG/CHI/SF(2:8)复合支架材料的优良理化性能在促进皮肤组织再生修复方面具有较优的应用潜力。接着,我们利用体外细胞培养技术,将3T3成纤维细胞与支架材料复合培养,通过MTT法、聚光共聚焦显微镜对复合支架材料促进细胞增殖和诱导细胞向材料内部迁移进行研究,MTT结果显示,BG/CHI、BG/SF、CHI/SF和BG/CHI/SF四种复合支架材料均无细胞毒性,在复合培养的后期(3d后)BG/CHI/SF复合支架材料表现出了比其他三种材料更优的促细胞增殖能力。而激光共聚焦扫描显微镜观察发现,BG/CHI/SF复合支架材料可以明显诱导成纤维细胞向复合支架材料内部迁移。为了深入研究复合支架材料对难愈创面的修复效果,我们建立了动物全层皮肤缺损模型,用制备的BG/CHI、BG/SF、CHI/SF和BG/CHI/SF四种复合支架材料来修复大鼠背部的全层皮肤损伤创面,之后对各组复合支架材料的修复效果进行评价,并探讨其修复机理。随着修复时间的增加,BG/CHI、BG/SF、CHI/SF以及BG/CHI/SF复合支架材料均具有生物可降解性,能够保持创面的湿润性,为伤口的恢复提供一个良好的微环境,CHI/SF和BG/CHI/SF复合支架材料在修复早期即表现出具有一定的抗感染效果。通过对创面愈合率及创面愈合时间的统计分析发现,BG/CHI/SF复合支架材料比BG/CHI、BG/SF、CHI/SF三种复合支架材料修复的愈合时间缩短了40%以上。组织学分析结果表明BG/CHI/SF复合支架材料能促进成纤维细胞的增殖和肉芽组织的快速形成,且对微血管的生成作用更显著,而且更有规则。我们进一步利用免疫组化染色对BG/CHI、BF/SF、CHI/SF和BG/CHI/SF四种复合支架材料促进创面修复部位新生血管和成熟血管的生成能力进行了评价和机理探讨,免疫组化染色结果显示,BG/CHI、BF/SF、CHI/SF和BG/CHI/SF四种复合支架材料均诱导了CD31和αSMA的表达,这提示四种复合支架材料均能促进创面修复部位新生血管和成熟血管的生成。通过对新生血管和成熟血管的统计分析,从修复初期到创面愈合的整个过程中,BG/CHI/SF复合支架材料组的CD31和αSMA的表达量均明显多于其他三组,肉芽组织中形成了更多的新生血管和成熟血管,表明BG/CHI/SF复合支架材料更有利于缺损修复部位的血管化,从而促进皮肤组织缺损的再生修复。综上所述,BG/CHI/SF复合支架材料作为一种新型皮肤组织工程支架材料,展现出了卓越的皮肤缺损修复性能和广泛的应用前景。


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