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重组E.coli全细胞高效催化乙酰乙酸甲酯不对称还原反应的研究

崔玉涵  
【摘要】:β-羟基酯是合成手性药物、农业化学品、香精香料等重要原料的手性中间体,可由β-酮酯类化合物发生还原反应制备得到。3-羟基丁酸甲酯(Methyl 3-hydroxybutyrate,HBME)具有抗老年痴呆症、抗骨质疏松和提高记忆力等功效,且聚(R)-HBME可作为人体组织移植材料。微生物全细胞催化法制备对映体纯的HBME具有稳定性好、选择性高、无需添加辅酶等优点,近年来,重组E.coli全细胞在生物全细胞催化领域得到越来越广泛的应用。目前,有关生物催化乙酰乙酸甲酯(Methyl acetoacetate,MAA)不对称还原合成(R)-HBME的研究虽然有过报道,但采用重组Escherichia coli(E.coli)细胞催化MAA不对称还原为(R)-HBME的较少,且可耐受底物浓度和获得的产物产率颇低。本团队前期工作筛选获得一株包含羰基还原酶的醋酸杆菌Acetobacter sp.CCTCC M209061,该菌能遵循反-Prelog规则高效高选择性的催化潜手性羰基化合物的不对称还原。然而,该野生型醋酸杆菌的生长需要大量的氮源,生物量低,且胞内酶系复杂,以上不足严重影响了其催化还原反应的效率以及它的工业应用前景。因此,针对以上问题,本研究首先采用基因工程手段,将该菌的关键羰基还原酶(AcCR)基因与来自Bacillus subtilis168的葡萄糖脱氢酶(GDH)基因共表达于E.coli细胞中。然后,本论文研究了高底物浓度下该重组E.coli细胞催化MAA不对称还原制备(R)-HBME的反应特性及影响规律;通过调节反应的pH值,使该反应达到较理想的底物浓度,并且在此条件下,考察了其扩大反应;最后,为适应工业化需要,进一步研究了固定化重组E.coli细胞催化MAA不对称还原反应的稳定性等特性,建立了(R)-HBME高效、高选择性合成体系。通过基因工程手段成功获得Acetobacter sp.CCTCC M209061的AcCR的关键基因,该基因序列是由762 bp碱基组成的完整阅读框,编码253个氨基酸,单亚基分子量约为27 kDa。此外,从枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168中,成功扩增得到葡萄糖脱氢酶GDH基因,该基因序列是由786 bp碱基组成的完整阅读框,编码261个氨基酸,分子量为28.7 kDa。通过AcCR与GDH在E.coli中共表达,获得了一株包含重组羰基还原酶AcCR基因(带有增加蛋白可溶性标签)和GDH基因的共表达大肠杆菌BL21(DE3)(pETDuet-gaccr-gdh),其在催化4’-氯苯乙酮不对称转化的同时,可以实现辅酶NADH的原位再生,细胞内酶的比活力达到304.9±4.57 U/g-dw,与野生醋酸杆菌相比,提高了9倍。该重组工程菌应用于催化β-酮酯类化合物的不对称还原(以MAA为模型底物)的反应中,通过反应条件的优化,重组E.coli细胞催化MAA不对称还原反应的最适初始缓冲液pH值为7.0、辅底物浓度为800 mM、反应温度为40℃、底物浓度为350 mM和振荡速率为200 rpm。在最适反应条件下,反应的初速度为10.28 mmol/min,产物的对映体过量值(e.e.)在99.9%以上,反应7 h后的最大产率达到85.3%。与野生菌株相比,重组E.coli细胞不对称催化还原MAA的效率更高。通过分批次添加不同碱性物质调节pH,对比了流加Na_2CO_3、葡萄糖酸钠(C_6H_(11)NaO_7)、精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)、组氨酸(His)和His-Na_2CO_3对重组E.coli细胞催化MAA不对称还原的影响,研究发现,流加以上6种碱性物质,均提高了该不对称还原反应的效率。其中,在1000 mM的高底物浓度下,通过His-Na_2CO_3复合流加方法调节反应的pH,达到了较理想的效果,反应8小时后,生成了747 mM的(R)-HBME,时空产率约为2.241 mol/L·d,解决了以往研究中底物浓度低的问题。此外,在此基础上进行扩大反应,在1000 mM的高底物浓度下,反应24 h后,(R)-HBME的产率和e.e.值分别为84%和99.9%,为实现工业化提供了依据。本研究采用海藻酸钙包埋法对重组E.coli细胞进行固定化,所得固定化细胞在储藏稳定性、热稳定性和操作稳定性均优于游离细胞,且其催化MAA还原反应的产率与游离细胞相当(约92%),产物的e.e.值均在99.9%以上;固定化细胞的最适底物浓度为600m M,大大优于游离细胞,可见固定化细胞可耐受更高的底物浓度。本研究不仅初步阐明了重组E.coli细胞催化MAA不对称还原反应的反应特性及影响规律,丰富了生物催化β-酮酯类化合物高效转化的理论基础,而且初步探讨了固定化重组E.coli细胞催化MAA不对称还原反应的特性,为生物还原β-酮酯提供了一条行之有效的新途径。


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