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米曲霉脂肪酶AOL的酶学性质、晶体学及定点突变研究

赵格  
【摘要】:甘油单酯和二酯脂肪酶是一类具有特殊底物选择性的脂肪酶,它们几乎只作用于甘油单酯和甘油二酯底物,而不作用于甘油三酯底物。其特殊的底物选择特性使其在工业应用中极具潜力。酶蛋白三维结构的解析,有利于深刻理解该类酶的结构功能关系,并为酶的理性改造提供结构基础。遗憾的是,目前单酯与二酯脂肪酶晶体结构信息仍然缺乏。本课题以来源于米曲霉的甘油单酯和二酯脂肪酶Aspergillus oryzae lipase(AOL)为研究对象,采用毕赤酵母异源表达了该脂肪酶并表征了其酶学性质,解析了其晶体结构,利用定点突变和生物信息学分析等方法初步研究了AOL结构和功能关系。主要研究内容以及结果如下:(1)AOL在毕赤酵母中异源表达、纯化及酶学性质研究。发酵了AOL组成型表达的毕赤酵母工程菌株,利用阴离子交换层析对重组AOL进行分离纯化,SDS-PAGE分析发现目标蛋白条带不均一。去糖基化酶处理实验证实,AOL在毕赤酵母中异源表达发生了糖基化。酶学性质表征结果显示:重组AOL的最适温度为50℃,最适pH为6.0。在中温(30~50℃)、偏酸性及中性条件下比较稳定,最适醇和脂肪酸底物分别为甘油和癸酸。(2)AOL的基因克隆以及在大肠杆菌中异源表达、纯化。为获得无糖基化修饰的AOL蛋白,将AOL基因克隆至pFL-B13cl表达载体上,并转化至大肠杆菌SHuffle T7中进行异源表达。在15℃、0.4mM IPTG条件下诱导培养18小时后,大部分SUMOAOL重组蛋白为可溶表达。利用SUMO蛋白酶酶切结合镍柱纯化可获得纯度较高的无SUMO蛋白标签的重组AOL蛋白。(3)AOL的晶体结构解析。采用凝胶过滤层析进一步纯化获得高纯度的AOL蛋白。在蛋白浓度10mg/m L、20℃、0.1M Bis-Tris pH6.4、41%w/v polypropylene glycol P400条件下获得了具有较高衍射质量的晶体。AOL的晶体结构(PDB ID:5XK2)通过分子置换的方法得以解析,其分辨率为1.7?。AOL呈现典型的α/β水解酶折叠结构,由8个β折叠片和11个α螺旋组成。AOL的催化三联体由Ser153、Asp206和His268组成,氧负离子洞由Ser91和Leu154的主链NH基组成。(4)AOL突变体的制备及酶学性质研究。根据AOL晶体结构的分析和参考已有的研究成果,选择V269关键位点进行定点突变。构建获得了V269I、V269L、V269E、V269Q、V269D、V269R和V269A 7个突变体,并通过毕赤酵母表达和离子交换层析纯化,获得了较高纯度的重组AOL突变体蛋白。甘油二酯底物水解结果显示,相比于野生型,亲水性氨基酸替代突变体V269D、V269E、V269R、V269Q水解活力分别有6.1、3.0、2.5、1.2倍的增加。甘油和油酸底物酯化实验结果发现,亲水性氨基酸替代突变体V269D、V269E、V269R、V269Q的酯化活力分别有2.6、1.6、1.6、1.4倍的增加。小体积氨基酸替代突变体V269A的水解活力和酯化活力分别有2.3和1.2倍的提高。然而,强疏水性氨基酸替代突变体V269L和V269I的水解活力和酯化活力有轻微的下降。最后,采用了同源模拟和分子对接等生物信息学手段初步探讨了V269位点各个突变体活力变化的原因。


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