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近江牡蛎多肽的分离纯化及其抗氧化、抗光老化活性研究

叶昱辉  
【摘要】:近江牡蛎(Ostrea rivularis)属于软体动物门,瓣鳃纲,牡蛎科。广泛分布于我国的南北沿海,其中广东沿海地区对近江牡蛎的养殖有三百余年的悠久历史。牡蛎肉味鲜美,营养价值极高,具有“海中牛奶”的美称。牡蛎多肽也具有着良好的生物活性,可用于功能食品的开发。本文运用酶解法制备近江牡蛎多肽,对其进行分离纯化和结构鉴定,并评价了其抗氧化和抗光老化活性。主要研究结果如下:(1)首先测定了近江牡蛎原料的基本化学组成,结果表明其含有水分62.67%,粗蛋白11.12%,总糖3.97%,灰分1.73%,因蛋白含量较高,故适合作为酶解底物。采用Alcalase 2.4L酶解法制备近江牡蛎多肽,运用响应面优化酶解工艺条件,得到的最佳工艺条件为:酶解时间为5.19 h,pH值为8.31,加酶量为2.12%,所得酶解产物命名为OP,其ORAC值为405.53 TEμmol/g,蛋白质回收率为64.5±0.6%。(2)运用膜超滤法纯化近江牡蛎多肽OP,得到两个组分OP-Ⅰ(5kDa)和OP-Ⅱ(5kDa)。OP-Ⅰ的蛋白质回收率为70.2%,为主要成分,且ORAC活性显著高于OP-Ⅱ(p0.05)。采用Sephadex G-25葡聚糖凝胶柱对OP-Ⅰ进行分离纯化,得到组分OP-Ⅰa、OP-Ⅰb。对组分OP-Ⅰa进行UPLC-MS/MS结构解析,检测到其中含有13条多肽序列,以七肽居多,其序列分别为AHGAGVGE、GHVKDAT、PGNLKSAK、HVHNGRT、CSMANAV、WWGHKLDT、AGDDAPR、CTGPATCKCGSG、VKVYIAG、EAPLNPK、AGDDAPRA、TTLGDLIH、GILGLSKLLGD。(3)对多肽组分进行体外抗氧化活性评价(包括还原力、羟基自由基清除能力、超氧阴离子自由基清除能力、DPPH、ABTS自由基清除能力),发现组分OP-Ⅰa的抗氧化能力明显优于组分OP-Ⅰb。(4)组分OP-Ⅰa能显著提升UV辐照后的HaCaT细胞活力(p0.05),并呈现较好的剂量相关性。OP-Ⅰa在500μg/m L的浓度下能够显著抑制细胞活性氧自由基(ROS)的生成(p0.05)。(5)组分OP-Ⅰa通过MAPKs信号传导通路减轻HaCaT细胞的光老化损伤。UV辐照激发ROS的产生,ROS激活IL-1β、IL-6、IL-8炎症因子的释放。从而诱导p38 MAPK的磷酸化,促使c-Jun和c-Fos基因的表达,使其形成AP-1异源二聚体,发挥生物效应。同时,NF-κβ基因的表达上调,促进炎症因子的释放。OP-Ⅰa可以显著下调上述通路靶点基因的表达,从而调控HaCaT细胞的抗光老化效应。


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