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微藻中抗糖基化活性成分的筛选、纯化以及抗神经炎症的研究

孙培培  
【摘要】:随着人类寿命的延长,人口老龄化的加剧,神经退行性疾病尤其是阿尔兹海默症已经成为威胁人们健康和寿命的重大问题。探索具有预防阿尔兹海默症功能的营养成分并揭示其作用机制是当前食品科学领域的研究热点之一,特别是发掘对与阿尔兹海默症发生发展重要相关的蛋白质糖基化和神经炎症具有干预作用的食品成分,通过饮食预防已经成为人们保持健康的有效手段之一。微藻富有多种生物活性成分,这也使得其具有抗氧化、抗炎、抗肥胖等多种生理调节功能,是重要的食品和功能成分的天然来源。然而,关于微藻抗糖基化和抗神经炎症的作用鲜有报道。鉴于此,本论文通过体外模型系统评估了9株不同微藻的不同极性提取物抗晚期糖基化终产物(AGEs)形成的能力,筛选出具有显著抑制AGEs形成的微藻提取物,并建立了提取物中关键类胡萝卜素的分析方法;首次在微藻Nitzschia laevis中发现岩藻黄醇和岩藻黄素的大量存在,通过相关性分析和标准品验证,确定了其提取物中发挥抗糖基化作用的关键成分为岩藻黄醇和岩藻黄素;然后,在光自养、异养和混养模式下,构建了N.laevis的细胞生长、岩藻黄醇和岩藻黄素的生成和培养基基质消耗的非线性动力学模型,获得规模化生产岩藻黄醇和岩藻黄素的最佳培养工艺,并通过固相萃取和快速硅胶柱层析结合薄层色谱层析的方法分离纯化岩藻黄醇和岩藻黄素;此外,我们通过考察岩藻黄醇和岩藻黄素对自由基、活性羰基化合物的清除效果以及抑制自由基诱导的蛋白质氧化损伤程度,探究它们的抗糖基化机制;最后本文从细胞水平上研究了岩藻黄醇和岩藻黄素对神经炎症的影响。本研究结果为岩藻黄醇和岩藻黄素对于阿尔兹海默症的干预研究奠定了理论基础,同时为微藻功能性成分的开发提供了新思路。本论文的主要研究结果如下:(1)体外牛血清白蛋白-葡萄糖和牛血清白蛋白-甲基乙二醛模型筛选结果表明,5株海洋藻株的丙酮水提取物对于抑制AGEs形成的抑制能力显著优于其他藻株,并且呈浓度依赖关系。初步分析判断这些提取物中的有效成分是类胡萝卜素。(2)为研究所筛选出的5株海洋微藻提取物的类胡萝卜素组成,确定关键抗AGEs形成的化合物成分,建立了类胡萝卜素的HPLC-PDA和UPLC-PDA-IMS-TOFMS分离鉴定方法,并对其关键组分岩藻黄醇和岩藻黄素进行定性定量分析。结果表明,经方法学论证,所建立的方法灵敏、稳定、可靠,满足对岩藻黄醇和岩藻黄素的定性定量要求。通过相关性分析和标准品的体外抗AGEs形成的研究,发现岩藻黄醇和岩藻黄素均具有抑制AGEs形成的活性。(3)基于岩藻黄醇在微藻中的首次发现,并且未有硅藻N.laevis同时积累岩藻黄醇和岩藻黄素的报道,为研究高密度培养N.laevis大规模生产岩藻黄醇和岩藻黄素,通过动力学模型探究了N.laevis在不同培养方式中的生长以及积累岩藻黄醇和岩藻黄素的规律。研究表明,构建的N.laveis生长动力学、产物生成动力学和底物消耗动力学模型能很好地拟合三种模式下所得的实验数据。此外,混养培养方式更适合这两个代谢物的积累,且葡萄糖和硝酸钠的消耗影响它们的含量提高。(4)为获得高纯度岩藻黄醇和岩藻黄素,以便探究它们的抗糖基化和抗神经炎症活性,以N.laevis的岩藻黄醇和岩藻黄素提取物为研究对象,优化提取方法,建立分离纯化的方法,结果表明经过柱层析和薄层层析分离纯化后,可以同时获得98%纯度的岩藻黄醇和岩藻黄素。(5)为研究纯化的岩藻黄醇和岩藻黄素抑制AGEs形成的机制,考察了它们清除自由基的能力、捕获活性二羰基化合物的能力以及对自由基诱导的蛋白质氧化、羰基化的抑制作用。结果表明,岩藻黄醇和岩藻黄素均具有一定的自由基和活性二羰基清除能力,且具有显著的抑制自由基诱导的蛋白质氧化降解和羰基化的作用,从而发挥抑制AGEs形成的作用。(6)为研究纯化的岩藻黄醇和岩藻黄素对神经炎症的影响,以BV2小胶质细胞为研究对象,探讨它们对LPS诱导的小胶质细胞炎症反应的干预作用。结果表明,岩藻黄醇和岩藻黄素能够显著抑制LPS诱导的BV2小胶质细胞内ROS的生成及炎症相关因子IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2和iNOS的mRNA表达。此外,岩藻黄醇和岩藻黄素还能在蛋白水平显著降低LPS诱导的BV2细胞COX-2蛋白的过度表达,从而干预了LPS诱导的BV2小胶质细胞的炎症反应。


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