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毕赤酵母表面展示南极假丝酵母脂肪酶催化体系及其应用

张锟  
【摘要】:酵母表面展示技术又被称为“Arming yeast”技术,使外源蛋白或短肽的表达、纯化、固定化于一体,可以直接应用于全细胞催化,从而省去分泌外源蛋白提取纯化和固定化的繁琐工艺流程,节约成本。酵母表面展示酶在生物催化和生物转化制造生化产品等方面表现出良好的性能,是绿色生物制造领域的研究热点。本论文基于毕赤酵母展示技术进一步研究毕赤酵母表面展示南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)和毕赤酵母表面展示南极假丝酵母脂肪酶A(CALA)的非水相催化体系,并通过改造拓展应用范围,为开发酵母表面展示脂肪酶全细胞催化剂在绿色生物制造领域的潜在应用提供理论和技术基础。具体研究内容及结果如下:(1)毕赤酵母展示CALB催化酯化柑橘精油增香以13种柑橘精油为反应的底物和溶剂,研究酵母展示CALB催化以复杂成分混合物为底物时的酯化体系,解决复杂底物不同组分对于酶催化的影响。结果表面酶催化柑橘精油中酯类物质的含量有10%到1170%不等的增幅,且表现出新的芳香特性,抑菌性质也稍微增强。柑橘精油中的羧酸成分为酶催化精油中新增乙酯的酰基供体。(2)毕赤酵母酵母展示CALB催化转酯化体系及萜烯醇芳香酯合成以苯甲醇为底物,研究酵母展示CALB催化转酯化合成的体系。苯甲醇的摩尔转化率达到97.2%,重复反应5次,酵母展示CALB仍保留初始活力的82.3%。酵母展示CALB应用于多种萜烯醇和含苯环的芳香醇的合成,转化率大于80%。并初步探讨了酵母展示CALB催化酶法拆分顺反式同分异构体香叶醇-橙花醇的能力。(3)毕赤酵母表面展示CALB转酯化动力学拆分仲醇的立体选择特性在酵母展示CALB催化转酯化体系的基础上,研究有机溶剂中酵母展示CALB动力学拆分仲醇的催化体系,探讨CALB展示在毕赤酵母表面对于其立体选择特性的影响。毕赤酵母展示CALB催化拆分多种仲醇的对映体选择性值大于600,且该酶对于短直链仲醇具有偏好性,但不能催化空间位阻较大的仲醇。通过与商品酶Novozyme 435比较,毕赤酵母表面脂肪酶不影响酶的立体选择特性。研究在无溶剂和高浓度底物体系中评价酵母展示CALB催化仲醇的动力学拆分,结果发现该酶在无溶剂体系较有机溶剂体系具有更高的时空效率。(4)连接肽提高毕赤酵母展示CALB的催化活力在以上催化反应体系构建的基础上,通过在酵母展示CALB的锚定蛋白和展示蛋白之间插入连接肽改进细胞展示脂肪酶的催化活力。研究发现插入PAPAP连接肽的重组菌水解酶活力最高提升了114.8%,且重组菌的非水相酯化活力和转酯化活力最高分别提升了6.6倍和1.3倍。通过流式细胞仪分析和脂肪酶活性中心滴定方法证明插入连接肽提高了酵母展示CALB的载酶量,说明酵母展示CALB催化活力的提高与CALB载酶量的提高相关。(5)毕赤酵母表面展示CALA的构建及其非水相转酯化特性CALA与CALB不同对于大位阻的仲醇和叔醇有较高的催化能力。首先成功构建了毕赤酵母表面展示CALA菌株,其菌体水解活力达到6331.6 U/g,高于目前报道的80.4 U/g。同时探讨了其在非水相体系中的底物醇的选择性,并将其应用于催化转酯化合成丁酸橙花酯和动力学拆分DL-薄荷醇。并通过定点突变技术提高CALA催化拆分DL-薄荷醇的立体选择性,CALAL367I突变蛋白展示菌株动力学拆分DL-薄荷醇产物ee值由野生菌的63%提升至72.9%。


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