表面展示α-葡萄糖苷酶毕赤酵母的固定及其在低聚异麦芽寡糖合成中的应用

【摘要】：低聚异麦芽寡糖(IMO)作为一种功能性食品添加剂,受到越来越广泛的关注。毕赤酵母表面展示酶技术,是将生物酶固定在毕赤酵母表面,以提高酶的稳定性及重复利用性。以毕赤酵母表面展示酶细胞为催化剂,在固定床中连续催化麦芽糖底物合成IMO反应过程,毕赤酵母均匀分散在反应液,不能实现连续化操作。因而需要对毕赤酵母展示酶进行二次固定,即对酵母细胞进行固定,以加速毕赤酵母的沉降速度。本文以毕赤酵母表面展示α-葡萄糖苷酶(黒曲霉来源)催化麦芽糖底物合成IMO。利用四氧化三铁的高顺磁性,在四氧化三铁微球上包裹壳聚糖作为固定毕赤酵母细胞的载体。本文以微波法制备包覆壳聚糖的磁性微球,经戊二醛溶液处理后,用于展示酶毕赤酵母细胞的固定,并对固定化菌的性质及催化效果进行了研究。本课题的研究内容和结果如下:(1)分别以海藻酸钙包埋、戊二醛交联法对表面展示α-葡萄糖苷酶的毕赤酵母菌体(I-Pp-ANGL-GCW61)进行固定化研究,并在固定床中实现IMO的连续化生产。以海藻酸钙包埋法固定毕赤酵母菌体,固定床中,底物停留时间为28.26min时,IMO的转化率为6%(w/w)。以戊二醛交联毕赤酵母菌体,固定床中IMO转化率为21%(w/w),菌体转苷活力降低了70%。(2)以醛基修饰的壳聚糖磁性微球载体固定表面展示α-葡萄糖苷酶的毕赤酵母菌体(I-Pp-ANGL-GCW61),表面展示α-葡萄糖苷酶的毕赤酵母菌体(Pp-ANGL-GCW61)经固定化及冻干后其转苷合成活力为游离菌体转苷合成活力的85%,I-Pp-ANGL-GCW61热稳定性良好,55℃时其转苷合成活力半衰期达36 h。通过优化菌体的固定化量,结果表明单位质量载体Pp-ANGL-GCW61最优固定化量为5.863 g,Pp-ANGL-GCW61固定化效率为51.83%。(3)研究I-Pp-ANGL-GCW61的重复利用次数对菌体活力影响,结果表明,1-5次重复利用中α-葡萄糖苷酶活力维持在80%以上。(4)设计并制作一套固定床反应器,在固定床反应器中填充I-Pp-ANGL-GCW61用以连续催化麦芽糖底物合成低聚异麦芽寡糖(IMO)。固定床中填充30 g固定化菌体,优化底物停留时间,当停留时间为36.42 min时,IMO产率最高为12.12 g/h,底物转化率为36.69%。相较于间歇釜中35.8 g/L/h的IMO生产效率,固定床中的IMO生产效率提高了19.83%,达到42.9 g/L/h。