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玛咖根部多糖的结构鉴定及免疫调节活性的研究

张猛猛  
【摘要】:玛咖虽然原产地是秘鲁,但我国自引种玛咖以来已成为世界上的玛咖主要出产国。然而近些年来,我国的玛咖市场陷入了低谷。造成这一结果的原因之一就是对于玛咖的物质组成和生理活性没有正确而全面的认识。玛咖多糖作为玛咖的活性成分之一,在近年来逐渐受到关注。但是目前的研究多以我国的玛咖为主,对于原产地秘鲁玛咖中多糖的结构解析和生理活性的探索还很缺乏。因此本文以秘鲁玛咖干根为原料,从中分离出两种多糖,对这两种多糖的基本结构和生理活性进行了研究。主要研究结果如下:(1)作者首先研究了实验中所用的秘鲁玛咖中的纤维素、淀粉、蛋白质、脂类等基本组成成分的含量。另外,采用水提法提取玛咖多糖,通过单因素法优化了玛咖多糖的提取工艺,确定了最佳提取条件为料液比1:30,提取温度100℃,提取时间2 h,提取次数为一次。最终使用最佳提取条件所得到的玛咖多糖的得率为6.13%。之后通过离子交换柱层析和葡聚糖凝胶柱层析纯化出三种玛咖多糖MC-1、MC-2和MC-3。选取MC-1和MC-2为后续实验的研究对象。MC-1和MC-2的多糖纯度分别为97.5%和98.3%。之后通过紫外光谱扫描和内毒素检测确认MC-1和MC-2中不含核酸、蛋白质和内毒素等杂质。通过TG-DSC发现MC-1和MC-2具有良好的热稳定性,其中MC-2的热稳定性要好于MC-1。(2)然后通过高效凝胶渗透色谱、红外光谱扫描、气相质谱、甲基化分析、核磁共振和刚果红实验等解析了MC-1的基本结构,发现MC-1的分子量11.3 kDa,主要是由阿拉伯糖(26.21%),甘露糖(11.81%)和葡萄糖(53.66%)和半乳糖(8.32%)组成,主要的糖苷键类型是(1→5)-α-L-Ara,(1→3)-α-L-Man,(1→2,6)-α-L-Man,(1→)-α-D-Glc,(1→4)-α-D-Glc,(1→6)-α-D-Glc and(1→6)-β-D-Gal。作者以小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞为模型,研究了MC-1的免疫调节活性。结果表明MC-1可以增强小鼠巨噬细胞细胞的吞噬能力,增加NO,TNF-α和IL-6的表达和分泌,说明MC-1具有显著的免疫调节活性。此外,MC-1在RAW 264.7细胞膜表面的识别受体为TLR2,CR3和MR。(3)作者用同样的方法对MC-2的基本结构进行了鉴定。结果表明MC-2是一种分子量为9.83kDa的多糖,其主要由阿拉伯糖(20.9%),甘露糖(4.5%),葡萄糖(71.9%)和半乳糖(2.7%)组成。MC-2的主要糖苷键连接类型是(1→5)-α-L-Ara,(1→3)-α-L-Man,(1→)-α-D-Glc,(1→4)-α-D-Glc,(1→6)-α-D-Glc和(1→6)-β-D-Gal,而且MC-2具有三螺旋的空间构象。在以RAW 264.7细胞为模型的免疫活性评价试验中,MC-2表现出比MC-1更高的对免疫调节活性。此外,MC-2不仅可以诱导M0型巨噬细胞向M1型极化,还可以使M2型巨噬细胞转化为M1表型。尽管MC-2不能将巨噬细胞从M1型转为M2型,但它仍然可以抑制LPS诱导的炎症反应。而MC-2是通过TLR2,TLR4,CR3和MR四种受体来激活巨噬细胞的。(4)在以Caco2细胞单层膜为模型的研究中,发现MC-1和MC-2难以被小肠吸收。但是MC-1和MC-2可以促进Caco2细胞分泌IL-8、IL-10、IL-12和INF-γ等细胞因子,并能够通过Caco2细胞单层膜促进RAW264.7细胞分泌TNF-α、IL-6和NO等细胞因子。此外,MC-1和MC-2还可以通过调节TLR4受体的转录水平来调节ZO-1和occludin等蛋白的表达,进而改善LPS导致的Caco2单层膜致密性的损伤。同时MC-1和MC-2还可以抑制LPS引起的Caco2细胞的TNF-α、IL-8和INF-γ等炎症因子的分泌,并提高IL-10等抗炎因子的分泌。(5)作者还对MC-1和MC-2抗肿瘤、抗氧化、抗病毒和抗脂肪肝等生理活性进行了初步探索。发现MC-1和MC-2拥有较弱的直接抑制肿瘤细胞增殖的能力,但MC-1和MC-2能通过激活巨噬细胞展现较强的抑制肿瘤增殖的活性;MC-1和MC-2的自由基清除能力和还原力都很弱,但MC-1和MC-2能够很好的保护AAPH产生的自由基对红细胞和肝细胞的氧化损伤;MC-1和MC-2几乎没有抗HBV的活性,仅MC-2在较高浓度时对HBeAg有一定的抑制作用;MC-1对于油酸和棕榈酸诱导的肝细胞的脂肪变性没有缓解作用,而MC-2对此展现出了较好的改善能力。以上的研究结果表明,MC-1和MC-2是一种新的玛咖多糖,其对巨噬细胞和肠道免疫系统具有显著的免疫调节活性,并且在抗肿瘤、抗氧化和抗脂肪肝方面表现出一定的潜力。这些结果为玛咖多糖更深入的研究和应用奠定了基础。


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