三聚甘油单月桂酸酯的酶法合成、广谱抗菌活性及其作用机制研究

【摘要】：甘油单中链脂肪酸酯是传统的食品添加剂,兼具乳化性和抑菌防腐性能。目前采用的月桂酸单甘酯等甘油单中链脂肪酸酯存在水溶性差、影响食品风味等问题,限制了其在食品中的应用;聚甘油中链脂肪酸酯以其极性可调、无杂味、抗菌谱广等特点,成为发展的方向,但是聚甘油中链脂肪酸酯合成路线长、分离纯化困难,目前研究与应用多是采用成分复杂的混合物来进行,缺少高纯单体的抑菌活性和系统深入的机理研究。因此,本论文制备了三聚甘油单月桂酸酯(TGML)高纯单体,深入研究了TGML的广谱抗菌活性以及其多种作用机制,并在复原牛奶中进行了应用探究。具体实验结果如下:(1)TGML的酶法合成、分离纯化和结构表征:采用脂肪酶Lipozyme 435催化三聚甘油和月桂酸合成TGML,优化后的工艺条件为:三聚甘油:月桂酸为1.08:1(mol:mol),反应温度为84.93℃,反应时间为6 h,酶添加量为1.32%,产物中TGML含量为49.76%;粗产物经二级分子蒸馏结合乙酸乙酯加水萃取可获得纯度为98.30%的三聚甘油单酯纯品;经过傅里叶红外光谱,电喷雾质谱和核磁共振碳谱表征,纯品确是TGML,且为线性构型。(2)TGML的理化性质和表面活性研究:TGML为无色无味的高纯单体;相比于甘油单硬脂酸酯,TGML的酸值、皂化值和熔点明显更低,碘值稍高;TGML的亲水亲油平衡值为9.89,可作为水包油型乳化剂;表面活性比较可知TGML的界面性质要明显优于甘油单硬脂酸酯。(3)TGML对致病性细菌和酵母抑制效果及作用机制的研究:TGML对大肠杆菌,鼠伤寒沙门氏菌,金黄色葡萄球菌,单核细胞增生李斯特菌,白色念珠菌和新生隐球菌的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度均低于苯甲酸钠和山梨酸钾;pH不影响TGML抗菌效果;其对致病菌的抑制时间也优于苯甲酸钠和山梨酸钾;抗菌机制实验揭示TGML会增加细菌和酵母细胞膜通透性,破坏细胞完整性,导致细胞表面凹陷和孔洞,并同步引起细胞周期停滞和生物大分子合成抑制。(4)TGML对食源性霉菌抑制效果及作用机制的研究:TGML对霉菌菌落和菌丝生长的抑制作用强于苯甲酸钠和山梨酸钾;其对黄曲霉,串珠镰刀菌和鲜绿青霉的半数抑制浓度分别为79.00、44.86和10.59μg/m L;在不同pH条件下,TGML的抗霉菌活性保持稳定;TGML显示出对霉菌孢子萌发的显著抑制效果;抗菌机制研究表明TGML会降低霉菌麦角甾醇含量,增加胞内物质泄漏,抑制呼吸酶活,但不影响脂质过氧化。(5)TGML的应用研究:TGML显示出对复原牛奶中阪崎克罗诺杆菌的显著抑制效果;温度高于或低于室温会增强TGML抑菌活性,降低pH也会提升TGML抗菌作用,但离子强度对其活性的影响不明显;模拟胃液会削弱TGML在牛奶中的抗菌效果;TGML和环境因素(温度、pH和离子强度)不会改变牛奶的颜色和香气。综上所述,本论文采用酶法合成、分子蒸馏结合乙酸乙酯加水萃取的纯化工艺,获得纯度为98.30%的TGML高纯单体;TGML具有对食源性细菌、酵母和霉菌的广谱抑菌活性,并阐明了其对胞膜和胞内多种干扰作用的协同抑制机制。因此,本研究将会为食品、药品及日化行业提供一种兼具乳化性与防腐性的多功能添加剂,极具应用价值;并且抗菌机制的系统研究也为抗菌剂的开发与理论研究提供了参考。