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毕赤酵母高效转录终止序列的筛选与应用评价

唐小雁  
【摘要】:甲基营养型毕赤酵母是外源蛋白表达的常用宿主,表达盒元件在外源蛋白表达中具有重要作用。毕赤酵母中常用的终止序列是AOX1 TT,是否能够找到更好的终止序列来替换AOX1 TT,对于毕赤酵母外源蛋白表达十分重要。本研究以基因表达盒中的重要元件终止序列为研究对象,通过筛选来自毕赤酵母内源的终止序列,同时应用酿酒酵母的合成终止序列,确定了终止序列在外源蛋白表达中的重要作用,并通过实验探究了其他因素如启动子及报告蛋白对终止序列在外源蛋白表达中作用的影响。具体研究内容及结果如下:(1)本研究通过对毕赤酵母内源转录终止序列进行核小体占据预测,并应用酿酒酵母合成终止序列,实现了终止序列替换毕赤酵母菌株的构建。通过对重组毕赤酵母菌株的拷贝数进行测定,排除了拷贝数对外源蛋白表达的影响。(2)通过对EGFP荧光进行测定,发现重组菌株的荧光表达量均有所提高,其中0104终止序列荧光表达量提高最多,相较于AOX1 TT的相对荧光提高了约65%。替换酿酒酵母合成终止序列中,Tsy3终止序列荧光表达量提高最多,相较于AOX1 TT的相对荧光提高了约48%。证明终止序列可以应用于提高外源蛋白表达中。(3)通过荧光定量PCR分析,发现重组菌株EGFP基因的转录水平均有所提高,其中0104终止序列的转录水平提高最多,是AOX1 TT的约3.7倍。替换酿酒酵母合成终止序列中,Tsy3提高最多,是AOX1 TT的约2.4倍。证明终止序列可以影响基因的转录水平。(4)通过构建带有不同启动子以及报告蛋白的终止序列替换毕赤酵母菌株,并对其外源蛋白表达的效果进行评价,发现外源蛋白基因和启动子对于终止序列的效果会有一定影响。对于终止序列本身,必需元件长度越长,终止序列对于外源蛋白表达的提升效果越明显。本研究验证了终止序列在毕赤酵母外源蛋白表达中的作用,为在毕赤酵母和其他真核细胞中通过表达元件优化提高重组蛋白表达量提供基础理论依据。


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