重组人源抗HBsAg单链抗体在大肠杆菌和巴氏毕赤酵母中的表达、纯化与性质鉴定

【摘要】：乙型肝炎病毒感染是全球性公共卫生问题,现有3.5 亿患者受其困扰,能和乙肝病毒表面特异性位点结合并封闭其侵袭肝细胞活性的单克隆抗体和抗体片段是唯一能用于紧急预防的生物制品。本文在前期工作的基础上,将筛选到的抗HBsAg Fab 片段改造成单链抗体(single-chain Fv against HBsAg, HBscFv),分别在大肠杆菌和巴氏毕赤酵母中表达,并对表达产物进行纯化及体内外生物学活性和理化性质鉴定。 采用基因重叠延伸拼接法构建抗HBsAg 单链抗体基因,测序确认后,亚克隆至原核表达载体pQE-40,获得表达质粒pQE-HBscFv,并转入宿主菌E.coli M15[pREP4],获得工程菌M15[pQE-HBscFv];工程菌经IPTG 诱导后,合成大量重组HBscFv,其含量可达菌体总蛋白的31.2%;进一步实验表明,重组HBscFv主要以包涵体的形式存在于细胞质中;将表达质粒pQE-HBscFv 转化有利于二硫键形成的氧化还原系统缺陷型宿主菌E. coli Origami(DE3),产物仍为包涵体;对包涵体进行简单复性后测定复性产物活性,结果表明,重组HBscFv 具有特异性结合HBsAg 活性。 对大肠杆菌表达的HBscFv 包涵体进行纯化和复性。优化条件诱导HBscFv表达,获得的包涵体采用4 种方案分别进行纯化,发现以IMAC 一步法纯化可得纯度超过85%的HBscFv,IMAC/GF 组合方案可得纯度超过97%的蛋白;对纯化的包涵体采用多种方法复性,发现透析法比稀释法或层析柱原位复性法效率更高,在透析复性法中,盐酸胍透析复性法比尿素透析复性法效率要高;在最优的复性条件下,蛋白回收率为(61.08±1.45)%,相对比活性为(2.66±0.13) A450/630 U/μg;在摇瓶培养阶段,重组HBscFv 的纯化产量为34.7 mg/L。 对重组HBscFv 的生物学活性和理化性质进行鉴定。非竞争酶免疫法亲和常数测定结果表明,HBscFv 是中等亲和力抗体,亲和常数为(2.30±0.32)×107 M-1;利用转基因小鼠测定重组HBscFv 在体内的中和活性,发现重组HBscFv 具有体内中和活性,中和效价为31.58 U/mg。应用MALDI-TOF MS 测定HBscFv 分子量,发现HBscFv 分子量为27314Da,与理论值相差只有8Da;对HBscFv 进行肽质量酶谱分析,结果在质谱图上找到超过60%的酶解片段,并且包含N 末端的5 个连