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人红白血病K562细胞基因表达谱芯片制作及应用研究

祝骥  
【摘要】:K562细胞是一株具有多方向分化潜能的人红白血病细胞系,可在多种化学诱导剂,如高铁血红素、羟基脲等的作用下向红细胞方向分化,是一个很好的研究肿瘤化学治疗及细胞分化的模型。 基因芯片技术则是近年来分子生物学与微电子学等多学科交叉融合而成的、能够进行高通量基因表达研究的最新手段,主要包括大量cDNA片段的制备,载体介质的选择与表面处理,cDNA点阵的打印,样品标记与分子杂交,以及芯片扫描与信息分析等内容。本文对K562细胞基因表达谱芯片的制作及应用该芯片对药物诱导K562细胞分化过程中基因表达变化进行了系统研究,结果如下: 1.基因表达谱芯片制作的首要问题是快速获取大量的cDNA探针。本研究以人红白血病K562细胞为材料,根据限制性显示PCR技术,建立了两种cDNA探针制备的新方法。一是对逆转录合成的cDNA进行限制性分组PCR扩增后,直接进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,并用核酸银染技术显示DNA条带,然后从凝胶上切下相应的条带,进行二次PCR大量扩增及纯化后作为基因芯片探针。二是将限制性分组PCR扩增产物同T载体连接,转化大肠杆菌,建立限制性分组cDNA文库。然后从文库中挑选克隆进行鉴定及大量扩增,作为探针。目前已用上述方法分离到K562细胞经羟基脲诱导分化前后的2628个cDNA片段,探针长度主要集中在250~750bp之间。并对部分cDNA片段进行了序列测定。其中包括肿瘤相关基因、细胞周期相关基因、细胞代谢途径相关基因、信号转导与转录调控相关基因等,发现了2个新的EST,可能是与K562细胞分化相关的基因。 2.对K562细胞基因表达谱芯片的制作条件进行了系统研究,确定了相关的参数。主要结果是:(1) PCR扩增的cDNA探针用2.5倍体积的无水乙醇及1/10体积的NaAc(pH 5.2)纯化成本低,得率高,较易溶解。(2) 研究了cDNA探针浓度及点样液,探针适合的浓度为0.3g/L,以50%的DMSO作为点样液,点阵扩散小,点样针不易被堵塞。(3) 分析了基因芯片制作中玻璃介质的表面处理对DNA固定率的影响,异硫氰酸基、氨基及醛基化等三种处理方法,DNA固定率相差不大,在70%左右,其中以异硫氰酸基化处理固定率较高,但操作较复杂,涉及试剂多,成本也高,而醛基处理最简单,试剂价廉,因而是较理想的处理方法。国


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