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重组人源抗HBsAg单链抗体—干扰素γ在巴氏毕赤酵母中表达的研究

周世水  
【摘要】:目前乙型肝炎病毒感染是全球性公共卫生问题,现有3.5亿患者受其困扰。随着抗HBsAg单克隆抗体和抗体片段的研究开发,发现能够和乙肝病毒表面特异性位点结合并封闭其侵袭肝细胞的活性,而融合了对病毒有较好临床治疗效果的干扰素γ的双功能抗体将能够起到导向性预防和治疗的双重作用。本文在前期工作的基础上,将抗HBsAg单链抗体(single-chain Fv against HBsAg,HBscFv)基因与干扰素γ(IFNγ)基因在体外拼接成单一基因,然后转入巴氏毕赤酵母中分泌表达,并对表达产物进行了纯化及体外生物学活性和理化性质鉴定。 体外基因及其表达载体的构建。首先是设计合适的引物并分别从含干扰素γ基因的载体和含抗HBsAg单链抗体的质粒中PCR扩增出干扰素γ基因和HBscFv基因。接着成功采用重叠PCR技术,通过基因SOEing方法将两基因拼接成单一基因HBscFv-IFNγ,并进行序列测定,其结果表明,所获得的基因产物为正确的HBscFv-IFNγ基因。将此HBscFv-IFNγ基因插入真核高效表达的载体pPICZaA中,获得含目的基因的表达载体pPICZaA/HBscFv-IFNγ,并成功转入E coli. TOP10。对此载体进行体外多拷贝的构建,最后成功地构建出pPICZaA/(HBscFv-INFγ)_2、pPICZaA/(HBscFv-INFγ)_4、pPICZaA/(HBscFv-INFγ)_6的表达载体,并分别成功转入E coli. TOP10。因此,通过液体培养可大量提取各类多拷贝含目的基因的表达载体,为进行酵母转化奠定了良好的基础。 在P. pastoris中分泌表达融合蛋白HBscFv-IFNγ。将测序确认正确的酵母表达质粒pPICZaA/HBscFv-IFNγ用酶PmeI线性化,同多拷贝表达载体pPICZaA/(HBScFv-IFNγ)n=2、4、6一起,分别采用LiCl法或电穿孔转化法转化P. pastoris GS115或X33,获得大量转化子。对转化菌落基因组进行PCR鉴定,发现70%转化子中含有目的基因HBscFv-IFNγ的整合。高浓度Zeocin抗性筛选试验,发现4%左右的转化子能够在含2000mg/L Zeocin的抗性平板上生长,并且电转化法的转化子中高抗性菌株比例稍微高于LiCl法转化子。将转化子经甲醇诱导培养后,发现培养上清中含有HBScFv-IFNγ样蛋白。对此蛋白用鼠抗HBscFv单克隆抗体作为第一抗体的Western-blotting分析表明,酵母培养上清中含有分子量为42kD的HBScFv-IFNγ融合蛋白。间接ELISA结果表明,酵母培养上清中的HBscFvI-IFN具有结合HBsAg活性。定量分析结果表明,酵母培


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