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酵母细胞原生质体拆合技术的研究

林炜铁  
【摘要】:细胞原生质体拆合技术是在细胞融合基础上、结合了基因工程技术而发展起来的一项新兴技术。本文试图在这一新的领域进行一些突破性的研究,本课题选择具有耐高温(42℃)、耐高酒精度(15%)特性的K氏酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的细胞核,与耐高糖(55%)的H15蜂蜜酵母(Nectaromyces sp.)经紫外线灭活的无核原生质体,进行原生质体拆合技术的研究,建立一条遗传育种的新型途径,为工业微生物育种提供了一个新的方法,并构造细胞核转移和真核细胞无核系统的实验模型,为分子水平和细胞水平的基因重组和遗传操纵的理论研究以及远缘杂交提供一种新的手段。 本论文主要包括以下几个方面的工作: 1.对影响酵母原生质体形成和再生的多种因素进行了深入的研究,如细胞生长期、酶系统、酶浓度、酶作用时间和作用温度、渗透压稳定剂、渗透压的变化、高渗缓冲液的pH值、高渗再生培养基、原生质体保护剂、细胞壁再生引物以及培养方式等,确定了制备K氏酵母的高活性原生质体的最优化条件,当原生质体的形成率为95~98%时,最高再生率达到了58.6%。此外还研究了原生质体的纯化。 2.分析比较了酵母细胞原生质体的三种不同破碎方法,即匀浆器法,酶解法、超声波法,发现利用电动玻璃-聚四氟乙烯匀浆机破碎酵母细胞原生质体,对细胞核的破坏程度较低,有利于制备高活性、完整的细胞核。


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