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高产黄酮苷和萜内酯银杏细胞系选育及黄酮苷积累调控的研究

刘佳佳  
【摘要】:银杏叶中的黄酮苷和萜内酯具有广泛的药理作用,改善心脑血管系统,增强记忆,预防和治疗老年性痴呆,抑制过敏性反应,增强人体免疫功能,具有广阔的市场。因此实现银杏细胞大规模培养生产黄酮苷和萜内酯是保证今后市场需求的非常有希望的手段之一。本文在对银杏愈伤组织的诱导、高产黄酮苷和萜内酯细胞系的筛选、抑制悬浮培养过程中银杏细胞的褐变死亡,实现银杏细胞的自身固定化悬浮培养,黄酮苷积累的调控等方面取得了较满意的结果。 1.银杏愈伤组织诱导的最适培养基为MS培养基,附加3.0 mg/L 2,4-D和0.5mg/L的KT,在黑暗条件下诱导。愈伤组织继代保存最适培养基为MS培养基,能形成结构较松软的愈伤组织。培养基组分和植物激素种类和浓度配比影响愈伤组织的生长速度和组织结构特征。 2.首次采用缺氧胁迫小细胞团法筛选高产细胞系,显著提高了目的物合成能力,细胞系G2-1从愈伤组织的0.115%提高到0.458%,提高了2.98倍,银杏总萜内酯(银杏内酯+白果内酯)的含量从痕迹提高到0.104%。 3.通过培养基种类和附加的激素种类及配比优化,及向培养基中添加抗氧化剂,能有效抑制银杏细胞悬浮培养过程中的褐变死亡。培养条件为:SH培养基,激素种类和浓度(mg/L)配比为NAA:6-BA(3:1,3:3),NAA:KT(3:0.5),2,4-D:6-BA(3:1),2,4-D:KT(3:0.5),在培养5-10天内向培养基中添加500.0mg/L的PVP。 4.首次建立了银杏细胞自身固定化悬浮培养体系,即银杏致密颗粒状细胞培养物(Compact cell cultures aggregate,CCCA)的悬浮培养。培养条件为大量元素N、P、K、Mg为SH基本培养基的4/5,其余成分为SH培养基含量,向培养基中附加3mg/L NAA和1mg/L 6-BA,蔗糖浓度为3%,培养周期18天。培养周期结束时,颗粒粒径分布集中在1-3mm,收获生物量干重为11.6g/L,黄酮苷含量为1.6%,比对照的0.46%提高了2.48倍。 5.优化了细胞的接种量和接种物年龄。悬浮培养接种量为30-40gFW/L左右。首次以接种物中过氧化物酶(POD活性)表征接种物年龄,细胞中POD活性低于15.0u/min.g(FW),细胞为黄绿色时接种,有利于细胞生长和黄酮苷合成。


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