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骨唾液酸蛋白在乳腺癌骨转移中作用的研究

杜红延  
【摘要】:乳腺癌是目前严重威胁女性健康的一类恶性肿瘤,占女性恶性肿瘤发病率的第一位。然而许多乳腺癌患者并不是直接死于原发乳腺肿瘤,而是死于肿瘤其他部位的扩散转移。其中骨是乳腺癌转移最常见的靶器官之一。深入研究肿瘤骨转移的分子和细胞学机制,可以更好的指导乳腺癌骨转移相关疾病的临床诊断和治疗。 骨唾液酸蛋白(Bone sialoprotein,简称BSP)是细胞外基质中的一种高度糖基化和磷酸化的酸性糖蛋白,富含唾液酸。其组织分布具有局限性,分布在矿化组织,包括骨、牙齿和钙化的软骨等,主要由成骨细胞、破骨细胞以及软骨细胞表达和分泌,参与组织矿化,与多种骨代谢性疾病有关,而近年来的研究又发现BSP与乳腺癌的骨转移密切相关。因而深入研究BSP在乳腺癌骨转移中的作用,揭示其作用机制,有可能为乳腺癌骨转移的预防和治疗提供新的药物靶点。 构建hBSP稳定高表达系统是研究hBSP在乳腺癌骨转移中作用的关键,本文通过构建hBSP的真核表达载体,并转染乳腺癌细胞,进行BSP促进乳腺癌骨转移的体内外试验研究。 首先构建hBSP与绿色荧光蛋白(GFP)非融合表达的分泌型真核表达载体pIRES2-hBSP-EGFP和膜靶向定位真核表达载体pID-hBSP-EGFP。从pB-hBSP中PCR亚克隆扩增带有分泌信号肽的hbsp基因片段,插入非融合表达的真核表达载体pIRES2-EGFP中,获得重组表达载体pIRES2-hBSP-EGFP,该载体插入hbsp基因片段带有分泌信号肽可以将表达的蛋白分泌至细胞外。同时将不带信号肽的hbsp基因片段插入膜靶向表达载体pDisplay中,构建真核表达载体pDisplay-hBSP,再以该载体为模板PCR扩增膜靶向定位信号肽、hBSP以及膜靶向定位蛋白基因片段,并插入pIRES2-EGFP中,获得重组表达载体pID-hBSP-EGFP,该载体可将hBSP蛋白表达定位于细胞膜。 将pIRES2-hBSP-EGFP和pID-hBSP-EGFP利用脂质体介导分别转染发生特异性骨转移和脑转移的乳腺癌细胞。经过转染条件的优化,最终确定96孔培养板中细胞融合度达到90%,用1μg脂质体介导280ng重组质粒转染10h可获得较满意的转染效率,最高可达19.70±1.10%。由G418对乳腺癌细胞杀伤曲线试验确定稳定转染细胞G418的筛选浓度为400μg/ml,G418抗性筛选和流式细胞仪荧光分选获得稳定转染pIRES2-hBSP-EGFP和pID-hBSP-EGFP重组表达载体的特异性骨转移乳腺癌细胞MDA-MB-231BO(pI)和MDA-MB-231BO(pID)。 细胞免疫组化结果表明乳腺癌细胞MDA-MB-231BO(pI)和


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